Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn gwneud y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Rhaid targedu fectorau genynnau ar gyfer trin ffibrosis systig pwlmonaidd at y llwybrau anadlu dargludol, gan nad oes gan drawsgludiad ysgyfaint ymylol unrhyw effaith therapiwtig.Mae effeithlonrwydd trawsgludiad firaol yn uniongyrchol gysylltiedig ag amser preswylio'r cludwr.Fodd bynnag, mae hylifau danfon fel cludwyr genynnau yn ymledu'n naturiol i'r alfeoli yn ystod anadliad, ac mae gronynnau therapiwtig o unrhyw siâp yn cael eu tynnu'n gyflym trwy gludiant mwcocilaidd.Mae ymestyn amser preswylio cludwyr genynnau yn y llwybr anadlol yn bwysig ond yn anodd ei gyflawni.Gall gronynnau magnetig cyfun cludwr y gellir eu cyfeirio at wyneb y llwybr anadlol wella targedu rhanbarthol.Oherwydd problemau gyda delweddu in vivo, ni ddeellir ymddygiad gronynnau magnetig mor fach ar wyneb y llwybr anadlu ym mhresenoldeb maes magnetig cymhwysol.Nod yr astudiaeth hon oedd defnyddio delweddu synchrotron i ddelweddu in vivo symudiad cyfres o ronynnau magnetig yn trachea llygod mawr anesthetig er mwyn astudio deinameg a phatrymau ymddygiad gronynnau sengl a swmp mewn vivo.Yna fe wnaethom hefyd asesu a fyddai danfon gronynnau magnetig lentifeirws ym mhresenoldeb maes magnetig yn cynyddu effeithlonrwydd trawsgludiad yn y tracea llygod mawr.Mae delweddu pelydr-X Synchrotron yn dangos ymddygiad gronynnau magnetig mewn meysydd magnetig llonydd a symudol mewn vitro ac in vivo.Ni ellir llusgo gronynnau'n hawdd ar draws wyneb llwybrau anadlu byw gan ddefnyddio magnetau, ond yn ystod cludiant, mae dyddodion wedi'u crynhoi yn y maes golygfa, lle mae'r maes magnetig ar ei gryfaf.Cynyddwyd effeithlonrwydd trawsgludo hefyd chwe gwaith pan ddanfonwyd gronynnau magnetig lentiviral ym mhresenoldeb maes magnetig.Gyda’i gilydd, mae’r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall gronynnau magnetig lentifeirws a meysydd magnetig fod yn ddulliau gwerthfawr o wella lefelau targedu fectorau genynnau a thrawsgludo yn y llwybrau anadlu dargludol in vivo.
Mae ffibrosis systig (CF) yn cael ei achosi gan amrywiadau mewn un genyn o'r enw rheolydd dargludiant trawsbilen CF (CFTR).Mae'r protein CFTR yn sianel ïon sy'n bresennol mewn llawer o gelloedd epithelial ledled y corff, gan gynnwys y llwybrau anadlu, safle mawr yn pathogenesis ffibrosis systig.Mae diffygion yn CFTR yn arwain at gludo dŵr annormal, dadhydradu arwyneb y llwybr anadlu, a llai o ddyfnder haen hylif arwyneb y llwybr anadlu (ASL).Mae hefyd yn amharu ar allu'r system cludiant mwcocilaidd (MCT) i glirio'r llwybrau anadlu o ronynnau wedi'u hanadlu a phathogenau.Ein nod yw datblygu therapi genynnau lentifeirws (LV) i gyflwyno'r copi cywir o'r genyn CFTR a gwella ASL, MCT, ac iechyd yr ysgyfaint, a pharhau i ddatblygu technolegau newydd a all fesur y paramedrau hyn yn vivo1.
Mae fectorau LV yn un o'r ymgeiswyr blaenllaw ar gyfer therapi genynnau ffibrosis systig, yn bennaf oherwydd y gallant integreiddio'r genyn therapiwtig yn barhaol i gelloedd gwaelodol y llwybr anadlu (bonyn-gelloedd llwybr anadlu).Mae hyn yn bwysig oherwydd gallant adfer hydradiad arferol a chlirio mwcws trwy wahaniaethu i gelloedd wyneb llwybr anadlu swyddogaethol wedi'u cywiro â genynnau sy'n gysylltiedig â ffibrosis systig, gan arwain at fanteision gydol oes.Rhaid cyfeirio fectorau LV yn erbyn y llwybrau anadlu dargludol, gan mai dyma lle mae cysylltiad yr ysgyfaint â CF yn dechrau.Gall danfon y fector yn ddyfnach i'r ysgyfaint arwain at drawsgludiad alfeolaidd, ond nid yw hyn yn cael unrhyw effaith therapiwtig mewn ffibrosis systig.Fodd bynnag, mae hylifau fel cludwyr genynnau yn mudo'n naturiol i'r alfeoli pan gânt eu hanadlu ar ôl genedigaeth3,4 ac mae gronynnau therapiwtig yn cael eu diarddel yn gyflym i geudod y geg gan MCTs.Mae effeithlonrwydd trawsgludiad LV yn uniongyrchol gysylltiedig â hyd yr amser y mae'r fector yn aros yn agos at y celloedd targed i ganiatáu derbyniad cellog - “amser preswylio” 5 sy'n hawdd ei fyrhau gan lif aer rhanbarthol nodweddiadol yn ogystal â derbyniad cydgysylltiedig o fwcws a gronynnau MCT.Ar gyfer ffibrosis systig, mae'r gallu i ymestyn amser preswylio LV yn y llwybrau anadlu yn bwysig i gyflawni lefelau uchel o drawsgludiad yn y maes hwn, ond hyd yn hyn mae wedi bod yn heriol.
Er mwyn goresgyn y rhwystr hwn, rydym yn cynnig y gall gronynnau magnetig LV (AS) helpu mewn dwy ffordd gyflenwol.Yn gyntaf, gallant gael eu harwain gan fagnet i wyneb y llwybr anadlu i wella targedu a helpu gronynnau cludwr genynnau i fod yn yr ardal gywir o'r llwybr anadlu;ac ASL) yn symud i mewn i haen gell 6. Defnyddir ASau yn eang fel cerbydau dosbarthu cyffuriau wedi'u targedu pan fyddant yn rhwymo i wrthgyrff, cyffuriau cemotherapi, neu foleciwlau bach eraill sy'n glynu wrth gellbilenni neu'n rhwymo i'w derbynyddion arwyneb celloedd priodol ac yn cronni mewn safleoedd tiwmor yn presenoldeb trydan statig.Meysydd magnetig ar gyfer therapi canser 7. Mae dulliau “hyperthermig” eraill wedi'u hanelu at ladd celloedd tiwmor trwy wresogi ASau pan fyddant yn agored i feysydd magnetig osgiliadol.Mae'r egwyddor o drawsnewidiad magnetig, lle mae maes magnetig yn cael ei ddefnyddio fel cyfrwng trawsnewid i wella trosglwyddiad DNA i gelloedd, yn cael ei ddefnyddio'n gyffredin mewn vitro gan ddefnyddio ystod o fectorau genynnau nad ydynt yn firaol a firaol ar gyfer llinellau celloedd anodd eu trawsgludo. ..Sefydlwyd effeithlonrwydd magnetotransfection LV gyda chyflwyno LV AS in vitro i linell gell o epitheliwm bronciol dynol ym mhresenoldeb maes magnetig statig, gan gynyddu effeithlonrwydd trawsgludiad 186 gwaith o'i gymharu â'r fector LV yn unig.Mae LV MT hefyd wedi'i gymhwyso i fodel in vitro o ffibrosis systig, lle cynyddodd trawsgludiad magnetig y trawsgludiad LV mewn diwylliannau rhyngwyneb aer-hylif gan ffactor o 20 ym mhresenoldeb sbwtwm ffibrosis systig10.Fodd bynnag, ychydig iawn o sylw a gafodd magnetotransfection organ in vivo a dim ond mewn ychydig o astudiaethau anifeiliaid11,12,13,14,15 y mae wedi'i werthuso, yn enwedig yn yr ysgyfaint16,17.Fodd bynnag, mae'r posibiliadau o drawsnewid magnetig mewn therapi ysgyfaint mewn ffibrosis systig yn glir.Mae Tan et al.(2020) y bydd “astudiaeth ddilysu ar gyflenwi nanoronynnau magnetig yr ysgyfaint yn effeithiol yn paratoi’r ffordd ar gyfer strategaethau mewnanadlu CFTR yn y dyfodol i wella canlyniadau clinigol mewn cleifion â ffibrosis systig”6.
Mae ymddygiad gronynnau magnetig bach ar wyneb y llwybr anadlol ym mhresenoldeb maes magnetig cymhwysol yn anodd ei ddelweddu a'i astudio, ac felly ni chânt eu deall yn dda.Mewn astudiaethau eraill, rydym wedi datblygu dull Delweddu Pelydr-X Cyferbyniol ar Sail Lledaeniad Synchrotron (PB-PCXI) ar gyfer delweddu anfewnwthiol a meintioli newidiadau munud mewn vivo yn nyfnder ASL18 ac ymddygiad MCT19,20 i fesur hydradiad wyneb sianel nwy yn uniongyrchol. ac fe'i defnyddir fel dangosydd effeithiolrwydd triniaeth cynnar.Yn ogystal, mae ein dull sgorio MCT yn defnyddio gronynnau diamedr 10-35 µm sy'n cynnwys alwmina neu wydr mynegrif plygiannol uchel fel marcwyr MCT sy'n weladwy gyda PB-PCXI21.Mae'r ddau ddull yn addas ar gyfer delweddu amrywiaeth o fathau o ronynnau, gan gynnwys ASau.
Oherwydd y cydraniad gofodol ac amser uchel, mae ein profion ASL a MCT sy'n seiliedig ar PB-PCXI yn addas iawn i astudio deinameg a phatrymau ymddygiad gronynnau sengl a swmp mewn vivo i'n helpu i ddeall a gwneud y gorau o ddulliau cyflwyno genynnau AS.Mae’r dull a ddefnyddiwn yma yn seiliedig ar ein hastudiaethau gan ddefnyddio llinell belydr SPring-8 BL20B2, lle gwnaethom ddelweddu symudiad hylif ar ôl rhoi dos o fector ffug i mewn i lwybrau anadlu trwynol a pwlmonaidd llygod i helpu i egluro ein patrymau mynegiant genynnau heterogenaidd a arsylwyd. yn ein geneu.astudiaethau anifeiliaid gyda dos cludo o 3.4 .
Nod yr astudiaeth hon oedd defnyddio'r synchrotron PB-PCXI i ddelweddu symudiadau in vivo cyfres o ASau yn trachea llygod mawr byw.Cynlluniwyd yr astudiaethau delweddu PB-PCXI hyn i brofi'r gyfres AS, cryfder maes magnetig, a lleoliad i bennu eu heffaith ar symudiad AS.Tybiwyd gennym y byddai maes magnetig allanol yn helpu'r MF a ddarperir i aros neu symud i'r ardal darged.Roedd yr astudiaethau hyn hefyd yn ein galluogi i bennu ffurfweddiadau magnet sy'n cynyddu faint o ronynnau sy'n weddill yn y tracea ar ôl dyddodiad.Mewn ail gyfres o astudiaethau, ein nod oedd defnyddio'r cyfluniad gorau hwn i ddangos y patrwm trawsgludo sy'n deillio o gyflwyno LV-MPs in vivo i'r llwybrau anadlu llygod mawr, ar y dybiaeth y byddai cyflwyno LV-MPs yng nghyd-destun targedu llwybrau anadlu yn arwain at hynny. mewn mwy o effeithlonrwydd trawsgludo LV..
Cynhaliwyd yr holl astudiaethau anifeiliaid yn unol â phrotocolau a gymeradwywyd gan Brifysgol Adelaide (M-2019-060 ac M-2020-022) a Phwyllgor Moeseg Anifeiliaid Synchrotron SPring-8.Cynhaliwyd yr arbrofion yn unol ag argymhellion ARRIVE.
Tynnwyd yr holl ddelweddau pelydr-x yn y beamline BL20XU yn y synchrotron SPring-8 yn Japan gan ddefnyddio gosodiad tebyg i'r hyn a ddisgrifiwyd yn flaenorol21,22.Yn fyr, roedd y blwch arbrofol wedi'i leoli 245 m o'r cylch storio synchrotron.Defnyddir pellter sampl-i-ganfodydd o 0.6 m ar gyfer astudiaethau delweddu gronynnau a 0.3 m ar gyfer astudiaethau delweddu in vivo i greu effeithiau cyferbyniad cyfnod.Defnyddiwyd pelydr monocromatig gydag egni o 25 keV.Cafwyd y delweddau gan ddefnyddio trawsddygiadur pelydr-X cydraniad uchel (SPring-8 BM3) ynghyd â synhwyrydd sCMOS.Mae'r trawsddygiadur yn trosi pelydrau-X yn olau gweladwy gan ddefnyddio pelydrydd 10 µm o drwch (Gd3Al2Ga3O12), sydd wedyn yn cael ei gyfeirio at y synhwyrydd sCMOS gan ddefnyddio amcan microsgop ×10 (NA 0.3).Y synhwyrydd sCMOS oedd Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) gyda maint arae o 2048 × 2048 picsel a maint picsel amrwd o 6.5 × 6.5 µm.Mae'r gosodiad hwn yn rhoi maint picsel isotropig effeithiol o 0.51 µm a maes golygfa o tua 1.1 mm × 1.1 mm.Dewiswyd hyd yr amlygiad o 100 ms i wneud y mwyaf o'r gymhareb signal-i-sŵn o ronynnau magnetig y tu mewn a'r tu allan i'r llwybrau anadlu tra'n lleihau arteffactau mudiant a achosir gan anadlu.Ar gyfer astudiaethau in vivo, gosodwyd caead pelydr-X cyflym yn y llwybr pelydr-X i gyfyngu ar y dos o ymbelydredd trwy rwystro'r pelydr-X rhwng datguddiadau.
Ni ddefnyddiwyd cyfryngau LV mewn unrhyw astudiaethau delweddu PB-PCXI SPring-8 oherwydd nad yw siambr ddelweddu BL20XU wedi'i hardystio gan Bioddiogelwch Lefel 2.Yn lle hynny, fe wnaethom ddewis amrywiaeth o ASau â nodweddion da o ddau werthwr masnachol yn cwmpasu ystod o feintiau, deunyddiau, crynodiadau haearn, a chymwysiadau , — yn gyntaf er mwyn deall sut mae meysydd magnetig yn effeithio ar symudiad ASau mewn capilarïau gwydr, ac yna yn llwybrau anadlu byw.wyneb.Mae maint yr AS yn amrywio o 0.25 i 18 µm ac fe'i gwneir o ddeunyddiau amrywiol (gweler Tabl 1), ond nid yw cyfansoddiad pob sampl, gan gynnwys maint y gronynnau magnetig yn yr AS, yn hysbys.Yn seiliedig ar ein hastudiaethau MCT helaeth 19, 20, 21, 23, 24, rydym yn disgwyl y gellir gweld ASau i lawr i 5 µm ar wyneb y llwybr anadlu tracheal, er enghraifft, trwy dynnu fframiau olynol i weld symudiad ASau yn well.Mae AS sengl o 0.25 µm yn llai na chydraniad y ddyfais ddelweddu, ond disgwylir i PB-PCXI ganfod eu cyferbyniad cyfeintiol a symudiad yr hylif arwyneb y cânt eu dyddodi arno ar ôl cael eu dyddodi.
Samplau ar gyfer pob AS yn y tabl.Paratowyd 1 mewn capilarïau gwydr 20 μl (Drummond Microcaps, PA, UDA) gyda diamedr mewnol o 0.63 mm.Mae gronynnau corpwswlaidd ar gael mewn dŵr, tra bod gronynnau CombiMag ar gael yn hylif perchnogol y gwneuthurwr.Mae pob tiwb wedi'i hanner llenwi â hylif (tua 11 µl) a'i roi ar ddaliwr y sampl (gweler Ffigur 1).Gosodwyd y capilarïau gwydr yn llorweddol ar y llwyfan yn y siambr ddelweddu, yn y drefn honno, a'u gosod ar ymylon yr hylif.Roedd magnet nicel-cragen 19 mm diamedr (28 mm o hyd) wedi'i wneud o bridd prin, neodymium, haearn a boron (NdFeB) (N35, cath. rhif LM1652, Jaycar Electronics, Awstralia) gyda gweddillion o 1.17 T wedi'i gysylltu â a. tabl trosglwyddo ar wahân i gyflawni Newid eich safle o bell yn ystod y rendro.Mae delweddu pelydr-X yn dechrau pan fydd y magnet wedi'i leoli tua 30 mm uwchben y sampl a chaiff delweddau eu caffael ar 4 ffrâm yr eiliad.Yn ystod delweddu, daethpwyd â'r magnet yn agos at y tiwb capilari gwydr (ar bellter o tua 1 mm) ac yna'i symud ar hyd y tiwb i asesu effaith cryfder a safle'r cae.
Gosodiad delweddu in vitro yn cynnwys samplau MP mewn capilarïau gwydr ar y cam o gyfieithu'r sampl xy.Mae llwybr y pelydr X wedi'i nodi â llinell ddotiog goch.
Unwaith y sefydlwyd gwelededd in vitro ASau, profwyd is-set ohonynt in vivo ar lygod mawr Wistar albino benywaidd tebyg i wyllt (~12 wythnos oed, ~200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) a butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Anestheteiddiwyd llygod mawr â chymysgedd Pharma (Japan) trwy chwistrelliad mewnperitoneol.Ar ôl anesthesia, cawsant eu paratoi ar gyfer delweddu trwy dynnu'r ffwr o amgylch y tracea, gosod tiwb endotracheal (ET; canwla mewnwythiennol 16 Ga, Terumo BCT), a'u rhwystro rhag symud yn y safle supine ar blât delweddu wedi'i wneud yn arbennig yn cynnwys bag thermol. i gynnal tymheredd y corff.22. Yna cysylltwyd y plât delweddu â'r cam samplu yn y blwch delweddu ar ongl fach i alinio'r trachea yn llorweddol ar y ddelwedd pelydr-x fel y dangosir yn Ffigur 2a.
(a) Gosodiad delweddu in vivo yn uned ddelweddu SPring-8, llwybr pelydr-X wedi'i farcio â llinell ddotiog goch.(b,c) Perfformiwyd lleoleiddio magnet tracheal o bell gan ddefnyddio dau gamera IP wedi'u gosod yn orthogonol.Ar ochr chwith y ddelwedd ar y sgrin, gallwch weld y ddolen wifren yn dal y pen a'r canwla dosbarthu wedi'i osod y tu mewn i'r tiwb ET.
Cysylltwyd system pwmp chwistrell a reolir o bell (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gan ddefnyddio chwistrell wydr 100 µl â thiwbiau PE10 (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) gan ddefnyddio nodwydd 30 Ga.Marciwch y tiwb i sicrhau bod y blaen yn y safle cywir yn y tracea wrth fewnosod y tiwb endotracheal.Gan ddefnyddio microbwmp, tynnwyd y plunger chwistrell a throchwyd blaen y tiwb yn y sampl MP i'w ddosbarthu.Yna gosodwyd y tiwb danfon wedi'i lwytho yn y tiwb endotracheal, gan osod y blaen ar y rhan gryfaf o'n maes magnetig cymhwysol disgwyliedig.Rheolwyd caffael delwedd gan ddefnyddio synhwyrydd anadl wedi'i gysylltu â'n blwch amseru yn seiliedig ar Arduino, a chofnodwyd yr holl signalau (ee, tymheredd, resbiradaeth, caead agored / cau, a chaffael delweddau) gan ddefnyddio Powerlab a LabChart (AD Instruments, Sydney, Awstralia) 22 Wrth Ddelweddu Pan nad oedd y gorchudd ar gael, gosodwyd dau gamera IP (Panasonic BB-SC382) tua 90° i'w gilydd a'u defnyddio i reoli safle'r magnet o'i gymharu â'r tracea yn ystod delweddu (Ffigur 2b, c).Er mwyn lleihau arteffactau symud, cafwyd un ddelwedd fesul anadl yn ystod y llwyfandir llif anadlol terfynol.
Mae'r magnet ynghlwm wrth yr ail gam, y gellir ei leoli o bell y tu allan i'r corff delweddu.Profwyd gwahanol safleoedd a chyfluniadau'r magnet, gan gynnwys: wedi'i osod ar ongl o tua 30 ° uwchben y tracea (dangosir cyfluniadau yn Ffigurau 2a a 3a);un magnet uwchben yr anifail a'r llall oddi tano, gyda'r polion wedi'u gosod ar gyfer atyniad (Ffigur 3b)., un magnet uwchben yr anifail ac un isod, gyda'r polion wedi'u gosod ar gyfer gwrthyriad (Ffigur 3c), ac un magnet uwchben ac yn berpendicwlar i'r tracea (Ffigur 3d).Ar ôl gosod yr anifail a'r magnet a llwytho'r MP dan brawf i'r pwmp chwistrell, rhowch ddos ​​o 50 µl ar gyfradd o 4 µl/eiliad ar ôl caffael y delweddau.Yna caiff y magnet ei symud yn ôl ac ymlaen ar hyd neu ar draws y tracea wrth barhau i gaffael delweddau.
Cyfluniad magnet ar gyfer delweddu in vivo (a) un magnet uwchben y tracea ar ongl o tua 30 °, (b) dau fagnet wedi'u ffurfweddu ar gyfer atyniad, (c) dau fagnet wedi'u ffurfweddu ar gyfer gwrthyriad, (d) un magnet uwchben ac yn berpendicwlar i'r tracea.Edrychodd yr arsylwr i lawr o'r geg i'r ysgyfaint trwy'r tracea ac roedd y pelydr X yn pasio trwy ochr chwith y llygoden fawr ac yn gadael yr ochr dde.Mae'r magnet naill ai'n cael ei symud ar hyd y llwybr anadlu neu i'r chwith ac i'r dde uwchben y tracea i gyfeiriad y pelydr X.
Fe wnaethom hefyd geisio pennu gwelededd ac ymddygiad gronynnau yn y llwybrau anadlu yn absenoldeb cymysgedd o resbiradaeth a chyfradd curiad y galon.Felly, ar ddiwedd y cyfnod delweddu, cafodd anifeiliaid eu lladd yn drugarog oherwydd gorddos pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, UDA; ~65 mg/kg ip).Gadawyd rhai anifeiliaid ar y llwyfan delweddu, ac ar ôl rhoi'r gorau i anadlu a churiad y galon, ailadroddwyd y broses ddelweddu, gan ychwanegu dos ychwanegol o AS os nad oedd AS yn weladwy ar wyneb y llwybr anadlu.
Cywirwyd y delweddau a ddeilliodd o hyn ar gyfer cae gwastad a thywyll ac yna eu cydosod i mewn i ffilm (20 ffrâm yr eiliad; 15-25 × cyflymder arferol yn dibynnu ar gyfradd resbiradaeth) gan ddefnyddio sgript arferiad a ysgrifennwyd yn MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Cynhaliwyd yr holl astudiaethau ar gyflenwi fector genynnau LV yng Nghanolfan Ymchwil Anifeiliaid Labordy Prifysgol Adelaide a'r nod oedd defnyddio canlyniadau arbrawf SPring-8 i asesu a allai cyflwyno LV-MP ym mhresenoldeb maes magnetig wella trosglwyddiad genynnau in vivo .Er mwyn gwerthuso effeithiau MF a maes magnetig, cafodd dau grŵp o anifeiliaid eu trin: chwistrellwyd un grŵp â LV MF gyda lleoliad magnet, a chwistrellwyd y grŵp arall gyda grŵp rheoli gyda LV MF heb fagnet.
Mae fectorau genynnau LV wedi'u cynhyrchu gan ddefnyddio dulliau a ddisgrifiwyd eisoes 25, 26 .Mae'r fector LacZ yn mynegi genyn beta-galactosidase niwclear lleoledig a yrrir gan hyrwyddwr cyfansoddol MPSV (LV-LacZ), sy'n cynhyrchu cynnyrch adwaith glas mewn celloedd trawsddwythol, sy'n weladwy ar flaenau ac adrannau o feinwe'r ysgyfaint.Perfformiwyd titradiad mewn diwylliannau celloedd trwy gyfrif â llaw nifer y celloedd LacZ-positif gan ddefnyddio hemocytomedr i gyfrifo'r titer mewn TU/ml.Mae cludwyr yn cael eu cryopreserve ar -80°C, eu dadmer cyn eu defnyddio, a'u rhwymo i CombiMag trwy gymysgu 1:1 a'u deor ar rew am o leiaf 30 munud cyn eu danfon.
Llygod mawr Sprague Dawley arferol (n = 3/grŵp, ~ 2-3 ip anesthetized gyda chymysgedd o 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Awstralia) a 60mg/kg ketamine (Ilium, Awstralia) yn 1 mis oed) ip ) pigiad a chanwleiddiad y geg nad yw'n llawfeddygol gyda chanwla mewnwythiennol 16 Ga.Er mwyn sicrhau bod meinwe llwybr anadlu tracheal yn derbyn trawsgludiad LV, cafodd ei gyflyru gan ddefnyddio ein protocol aflonyddiad mecanyddol a ddisgrifiwyd yn flaenorol y mae wyneb y llwybr anadlu tracheal yn cael ei rwbio'n echelinol â basged gwifren (N-Cylch, echdynnwr carreg nitinol heb domen NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, UDA) 30 t28.Yna, tua 10 munud ar ôl yr aflonyddiad yn y cabinet bioddiogelwch, perfformiwyd gweinyddiaeth draceol o LV-MP.
Roedd y maes magnetig a ddefnyddiwyd yn yr arbrawf hwn wedi'i ffurfweddu'n debyg i astudiaeth pelydr-x in vivo, gyda'r un magnetau yn cael eu dal dros y tracea â chlampiau stent distyllu (Ffigur 4).Dosbarthwyd cyfaint 50 µl (2 x 25 µl aliquots) o LV-MP i'r tracea (n = 3 anifail) gan ddefnyddio pibed â thip gel fel y disgrifiwyd yn flaenorol.Derbyniodd y grŵp rheoli (n = 3 anifail) yr un LV-MP heb ddefnyddio magnet.Ar ôl cwblhau'r trwyth, caiff y canwla ei dynnu o'r tiwb endotracheal a chaiff yr anifail ei ddileu.Mae'r magnet yn aros yn ei le am 10 munud cyn cael ei dynnu.Cafodd llygod mawr eu dosio'n isgroenol gyda meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Awstralia) ac yna tynnu'n ôl anesthesia trwy chwistrelliad mewnperitoneol o hydroclorid atipamazole 1 mg / kg (Antisedan, Zoetis, Awstralia).Cadwyd llygod mawr yn gynnes ac arsylwyd arnynt nes iddynt wella'n llwyr o anesthesia.
Dyfais ddosbarthu LV-MP mewn cabinet diogelwch biolegol.Gallwch weld bod llawes clo Luer-cloi llwyd golau y tiwb ET yn ymwthio allan o'r geg, ac mae'r blaen pibed gel a ddangosir yn y ffigwr yn cael ei fewnosod trwy'r tiwb ET i'r dyfnder a ddymunir i'r tracea.
Wythnos ar ôl y weithdrefn weinyddu LV-MP, aberthwyd anifeiliaid yn drugarog trwy fewnanadlu 100% CO2 ac aseswyd mynegiant LacZ gan ddefnyddio ein triniaeth X-gal safonol.Tynnwyd y tri chylch cartilag caudal mwyaf i sicrhau na fyddai unrhyw ddifrod mecanyddol neu gadw hylif oherwydd gosod tiwb endotracheal yn cael ei gynnwys yn y dadansoddiad.Torrwyd pob tracea yn ei hyd i gael dau hanner i'w ddadansoddi a'i roi mewn cwpan yn cynnwys rwber silicon (Sylgard, Dow Inc) gan ddefnyddio nodwydd Minutien (Fine Science Tools) i ddelweddu'r arwyneb goleuol.Cadarnhawyd dosbarthiad a chymeriad y celloedd trawsgludedig gan ffotograffiaeth flaen gan ddefnyddio microsgop Nikon (SMZ1500) gyda chamera DigiLite a meddalwedd TCapture (Tucsen Photonics, Tsieina).Cafwyd delweddau ar chwyddhad 20x (gan gynnwys y gosodiad uchaf ar gyfer lled llawn y tracea), gyda hyd cyfan y tracea yn cael ei arddangos gam wrth gam, gan ddarparu digon o orgyffwrdd rhwng pob delwedd i ganiatáu i ddelweddau gael eu “pwytho”.Yna cyfunwyd y delweddau o bob tracea yn un ddelwedd gyfansawdd gan ddefnyddio Golygydd Delwedd Cyfansawdd fersiwn 2.0.3 (Microsoft Research) gan ddefnyddio'r algorithm mudiant planar. Mesurwyd arwynebedd mynegiant LacZ o fewn y delweddau cyfansawdd tracheal o bob anifail gan ddefnyddio sgript MATLAB awtomataidd (R2020a, MathWorks) fel y disgrifiwyd yn flaenorol28, gan ddefnyddio gosodiadau o 0.35 < Hue < 0.58, Dirlawnder > 0.15, a Gwerth < 0.7. Mesurwyd arwynebedd mynegiant LacZ o fewn y delweddau cyfansawdd tracheal o bob anifail gan ddefnyddio sgript MATLAB awtomataidd (R2020a, MathWorks) fel y disgrifiwyd yn flaenorol28, gan ddefnyddio gosodiadau o 0.35 < Hue < 0.58, Dirlawnder > 0.15, a Gwerth < 0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Cafodd ardal mynegiant LacZ mewn delweddau tracheal cyfansawdd o bob anifail ei feintioli gan ddefnyddio sgript MATLAB awtomataidd (R2020a, MathWorks) fel y disgrifiwyd yn flaenorol28 gan ddefnyddio gosodiadau o 0.350.15 a gwerth<0 .7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 、 Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Cafodd ardaloedd mynegiant LacZ ar ddelweddau cyfansawdd o dracea pob anifail eu mesur gan ddefnyddio sgript MATLAB awtomataidd (R2020a, MathWorks) fel y disgrifiwyd yn flaenorol gan ddefnyddio gosodiadau o 0.35 < lliw < 0.58, dirlawnder > 0.15 a gwerth < 0.7 .Trwy olrhain cyfuchliniau meinwe yn GIMP v2.10.24, crëwyd mwgwd â llaw ar gyfer pob delwedd gyfansawdd i nodi'r ardal feinwe ac atal unrhyw ganfyddiadau ffug y tu allan i'r meinwe tracheal.Crynhowyd yr ardaloedd lliw o'r holl ddelweddau cyfansawdd o bob anifail i roi cyfanswm arwynebedd lliw yr anifail hwnnw.Yna rhannwyd yr ardal wedi'i phaentio â chyfanswm arwynebedd y mwgwd i gael ardal wedi'i normaleiddio.
Roedd pob tracea wedi'i fewnosod mewn paraffin ac wedi'i dorri'n adrannau 5 µm o drwch.Cafodd adrannau eu gwrth-staenio â choch cyflym niwtral am 5 munud a chaffaelwyd delweddau gan ddefnyddio microsgop Nikon Eclipse E400, camera DS-Fi3 a meddalwedd dal elfennau NIS (fersiwn 5.20.00).
Perfformiwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol yn GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Pennwyd arwyddocâd ystadegol ar p ≤ 0.05.Profwyd normalrwydd gan ddefnyddio prawf Shapiro-Wilk ac aseswyd gwahaniaethau mewn staenio LacZ gan ddefnyddio prawf-t heb ei baru.
Archwiliwyd y chwe AS a ddisgrifir yn Nhabl 1 gan PCXI, a disgrifir y gwelededd yn Nhabl 2. Nid oedd dau AS polystyren (MP1 ac MP2; 18 µm a 0.25 µm, yn y drefn honno) yn weladwy gan PCXI, ond gellid nodi'r samplau a oedd yn weddill (dangosir enghreifftiau yn Ffigur 5).Mae MP3 ac MP4 yn wan i'w gweld (10-15% Fe3O4; 0.25 µm a 0.9 µm, yn y drefn honno).Er bod MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) yn cynnwys rhai o'r gronynnau lleiaf a brofwyd, hwn oedd y mwyaf amlwg.Mae'n anodd gwahaniaethu rhwng cynnyrch CombiMag MP6.Ym mhob achos, roedd ein gallu i ganfod MFs wedi'i wella'n fawr trwy symud y magnet yn ôl ac ymlaen yn gyfochrog â'r capilari.Wrth i'r magnetau symud i ffwrdd o'r capilari, tynnwyd y gronynnau allan mewn cadwyni hir, ond wrth i'r magnetau agosáu a chynyddu cryfder y maes magnetig, byrhaodd y cadwyni gronynnau wrth i'r gronynnau fudo tuag at wyneb uchaf y capilari (gweler Fideo Atodol S1 : MP4), cynyddu'r dwysedd gronynnau ar yr wyneb.I'r gwrthwyneb, pan fydd y magnet yn cael ei dynnu o'r capilari, mae cryfder y cae yn lleihau ac mae'r ASau yn aildrefnu'n gadwyni hir sy'n ymestyn o wyneb uchaf y capilari (gweler Fideo Atodol S2: MP4).Ar ôl i'r magnet stopio symud, mae'r gronynnau'n parhau i symud am beth amser ar ôl cyrraedd y sefyllfa ecwilibriwm.Wrth i'r AS symud tuag at ac i ffwrdd o wyneb uchaf y capilari, mae'r gronynnau magnetig yn tueddu i dynnu malurion trwy'r hylif.
Mae gwelededd AS o dan PCXI yn amrywio'n sylweddol rhwng samplau.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6.Tynnwyd yr holl ddelweddau a ddangosir yma gyda magnet wedi'i leoli tua 10 mm yn union uwchben y capilari.Mae'r cylchoedd mawr ymddangosiadol yn swigod aer wedi'u dal yn y capilarïau, sy'n dangos yn glir nodweddion ymyl du a gwyn y ddelwedd cyferbyniad cam.Mae'r blwch coch yn nodi'r chwyddhad sy'n gwella'r cyferbyniad.Sylwch nad yw diamedrau'r cylchedau magnet ym mhob ffigur wrth raddfa a'u bod tua 100 gwaith yn fwy na'r hyn a ddangosir.
Wrth i'r magnet symud i'r chwith ac i'r dde ar hyd pen y capilari, mae ongl y llinyn AS yn newid i alinio â'r magnet (gweler Ffigur 6), gan amlinellu'r llinellau maes magnetig.Ar gyfer MP3-5, ar ôl i'r cord gyrraedd yr ongl trothwy, mae'r gronynnau'n llusgo ar hyd wyneb uchaf y capilari.Mae hyn yn aml yn arwain at ASau yn clystyru i grwpiau mwy yn agos at y man lle mae'r maes magnetig cryfaf (gweler Fideo Atodol S3: MP5).Mae hyn hefyd yn arbennig o amlwg wrth ddelweddu yn agos at ddiwedd y capilari, sy'n achosi'r AS i agregu a chanolbwyntio ar y rhyngwyneb hylif-aer.Nid oedd y gronynnau yn yr MP6, a oedd yn anos eu gwahaniaethu na'r rhai yn y MP3-5, yn llusgo pan symudodd y magnet ar hyd y capilari, ond dadunodd y llinynnau AS, gan adael y gronynnau yn y golwg (gweler Fideo Atodol S4: MP6).Mewn rhai achosion, pan gafodd y maes magnetig cymhwysol ei leihau trwy symud y magnet ymhell o'r safle delweddu, disgynnodd unrhyw ASau a oedd yn weddill yn araf i wyneb gwaelod y tiwb trwy ddisgyrchiant, gan aros yn y llinyn (gweler Fideo Atodol S5: MP3) .
Mae ongl y llinyn MP yn newid wrth i'r magnet symud i'r dde uwchben y capilari.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6.Mae'r blwch coch yn nodi'r chwyddhad sy'n gwella'r cyferbyniad.Sylwch fod y fideos ychwanegol at ddibenion gwybodaeth gan eu bod yn datgelu strwythur gronynnau pwysig a gwybodaeth ddeinamig na ellir ei ddelweddu yn y delweddau sefydlog hyn.
Mae ein profion wedi dangos bod symud y magnet yn ôl ac ymlaen yn araf ar hyd y tracea yn hwyluso delweddu'r MF yng nghyd-destun symudiad cymhleth in vivo.Ni chynhaliwyd unrhyw brofion in vivo oherwydd nad oedd y gleiniau polystyren (MP1 ac MP2) yn weladwy yn y capilari.Profwyd pob un o’r pedwar MF sy’n weddill yn in vivo gydag echel hir y magnet wedi’i gosod dros y tracea ar ongl o tua 30° i’r fertigol (gweler Ffigurau 2b a 3a), gan fod hyn wedi arwain at gadwyni MF hirach ac yn fwy effeithiol. na magned..terfynu cyfluniad.Nid yw MP3, MP4 ac MP6 wedi'u canfod yn trachea unrhyw anifeiliaid byw.Wrth ddelweddu llwybr anadlol llygod mawr ar ôl lladd yr anifeiliaid yn drugarog, roedd y gronynnau'n parhau i fod yn anweledig hyd yn oed pan ychwanegwyd cyfaint ychwanegol gan ddefnyddio pwmp chwistrell.Roedd gan MP5 y cynnwys haearn ocsid uchaf a hwn oedd yr unig ronyn gweladwy, felly fe'i defnyddiwyd i werthuso a nodweddu ymddygiad AS in vivo.
Arweiniodd gosod y magnet dros y tracea wrth fewnosod MF at ganolbwyntio llawer o MFs, ond nid pob un, yn y maes golygfa.Mae'n well arsylwi mynediad tracheal gronynnau mewn anifeiliaid sydd wedi'u ewthaneiddio'n drugarog.Ffigur 7 a Fideo Atodol S6: Mae MP5 yn dangos cipio magnetig cyflym ac aliniad gronynnau ar wyneb y tracea fentrol, gan nodi y gellir targedu ASau i ardaloedd dymunol y tracea.Wrth chwilio'n fwy pellennig ar hyd y tracea ar ôl cyflwyno MF, canfuwyd rhai MFs yn agosach at y carina, sy'n dangos cryfder maes magnetig annigonol i gasglu a dal pob MF, gan eu bod yn cael eu danfon trwy'r rhanbarth cryfder maes magnetig mwyaf yn ystod gweinyddu hylif.proses.Fodd bynnag, roedd crynodiadau ASau ôl-enedigol yn uwch o amgylch ardal y ddelwedd, sy'n awgrymu bod llawer o ASau yn aros mewn rhanbarthau llwybr anadlu lle'r oedd cryfder maes magnetig cymhwysol uchaf.
Delweddau o (a) cyn a (b) ar ôl danfon MP5 i mewn i dracea llygoden fawr ewthaneiddio gyda magnet wedi'i osod ychydig uwchben yr ardal ddelweddu.Mae'r ardal a ddarlunnir wedi'i lleoli rhwng dau gylch cartilaginous.Mae rhywfaint o hylif yn y llwybrau anadlu cyn i'r AS gael ei ddanfon.Mae'r blwch coch yn nodi'r chwyddhad sy'n gwella'r cyferbyniad.Mae'r delweddau hyn wedi'u cymryd o'r fideo a welir yn S6: Fideo Atodol MP5.
Arweiniodd symud y magnet ar hyd y tracea in vivo at newid yn ongl y gadwyn AS ar wyneb y llwybr anadlu, yn debyg i'r hyn a welwyd mewn capilarïau (gweler Ffigur 8 a Fideo Atodol S7: MP5).Fodd bynnag, yn ein hastudiaeth, ni allai ASau gael eu llusgo ar hyd wyneb llwybrau anadlol byw, fel y gallai capilarïau ei wneud.Mewn rhai achosion, mae'r gadwyn AS yn ymestyn wrth i'r magnet symud i'r chwith ac i'r dde.Yn ddiddorol, canfuom hefyd fod y gadwyn gronynnau yn newid dyfnder haen wyneb yr hylif pan fydd y magnet yn cael ei symud yn hydredol ar hyd y tracea, ac yn ehangu pan fydd y magnet yn cael ei symud yn uniongyrchol uwchben ac mae'r gadwyn gronynnau yn cael ei gylchdroi i safle fertigol (gweler Fideo Atodol S7).: MP5 ar 0:09, gwaelod dde).Newidiodd y patrwm symudiad nodweddiadol pan symudwyd y magnet yn ochrol ar draws top y tracea (hy, i'r chwith neu'r dde o'r anifail, yn hytrach nag ar hyd y tracea).Roedd y gronynnau'n dal i fod yn amlwg yn ystod eu symudiad, ond pan dynnwyd y magnet o'r tracea, daeth blaenau'r llinynnau gronynnau yn weladwy (gweler Fideo Atodol S8: MP5, gan ddechrau am 0:08).Mae hyn yn cytuno ag ymddygiad y maes magnetig a arsylwyd o dan weithred maes magnetig cymhwysol mewn capilari gwydr.
Delweddau enghreifftiol yn dangos MP5 yn trachea llygoden fawr anestheteiddiedig fyw.(a) Mae’r magnet yn cael ei ddefnyddio i gaffael delweddau uwchben ac i’r chwith o’r tracea, yna (b) ar ôl symud y magnet i’r dde.Mae'r blwch coch yn nodi'r chwyddhad sy'n gwella'r cyferbyniad.Daw'r delweddau hyn o'r fideo a welir yn Fideo Atodol S7: MP5.
Pan gafodd y ddau begwn eu tiwnio mewn cyfeiriadedd gogledd-de uwchben ac o dan y tracea (hy, denu; Ffig. 3b), roedd y cordiau AS yn ymddangos yn hirach ac wedi'u lleoli ar wal ochrol y tracea yn hytrach nag ar wyneb dorsal y trachea (gweler Atodiad).Fideo S9:MP5).Fodd bynnag, ni chanfuwyd crynodiadau uchel o ronynnau ar un safle (hy, arwyneb dorsal y trachea) ar ôl gweinyddu hylif gan ddefnyddio dyfais magnet deuol, sydd fel arfer yn digwydd gyda dyfais magnet sengl.Yna, pan gafodd un magnet ei ffurfweddu i wrthyrru polion gyferbyn (Ffigur 3c), ni chynyddodd nifer y gronynnau a oedd yn weladwy yn y maes golygfa ar ôl eu danfon.Mae sefydlu'r ddau ffurfweddiad dau fagnet yn heriol oherwydd cryfder maes magnetig uchel sy'n denu neu'n gwthio'r magnetau yn y drefn honno.Yna newidiwyd y gosodiad i un magnet yn gyfochrog â'r llwybrau anadlu ond gan basio trwy'r llwybrau anadlu ar ongl 90 gradd fel bod y llinellau grym yn croesi'r wal draceol yn orthogonol (Ffigur 3d), cyfeiriadedd a fwriadwyd i bennu'r posibilrwydd o agregu gronynnau ar y wal ochrol.cael ei arsylwi.Fodd bynnag, yn y cyfluniad hwn, nid oedd unrhyw symudiad cronni MF adnabyddadwy na symudiad magnet.Yn seiliedig ar yr holl ganlyniadau hyn, dewiswyd cyfluniad gydag un magnet a chyfeiriadedd 30 gradd ar gyfer astudiaethau in vivo o gludwyr genynnau (Ffig. 3a).
Pan gafodd yr anifail ei ddelweddu sawl gwaith yn syth ar ôl cael ei aberthu'n drugarog, roedd absenoldeb mudiant meinwe ymyrrol yn golygu y gellid dirnad llinellau gronynnau mân, byrrach yn y maes rhynggartilaginous clir, gan 'siglo' yn unol â mudiant trosiadol y magnet.gweld yn glir presenoldeb a symudiad gronynnau MP6.
Y titer o LV-LacZ oedd 1.8 x 108 IU/mL, ac ar ôl cymysgu 1:1 gyda CombiMag AS (MP6), chwistrellwyd anifeiliaid â 50 µl o ddogn tracheal o 9 x 107 IU/ml o gerbyd LV (hy 4.5 x 106 TU/llygoden fawr).).).Yn yr astudiaethau hyn, yn lle symud y magnet yn ystod y cyfnod esgor, fe wnaethom osod y magnet mewn un sefyllfa i benderfynu a ellid gwella trawsgludiad LV (a) o'i gymharu â danfoniad fector yn absenoldeb maes magnetig, a (b) a allai'r llwybr anadlu bod yn canolbwyntio.Y celloedd sy'n cael eu trawsgludo yn ardaloedd targed magnetig y llwybr anadlol uchaf.
Nid oedd yn ymddangos bod presenoldeb magnetau a'r defnydd o CombiMag mewn cyfuniad â fectorau LV yn effeithio'n andwyol ar iechyd anifeiliaid, fel y gwnaeth ein protocol dosbarthu fector LV safonol.Dangosodd delweddau blaen o'r rhanbarth tracheal sy'n destun aflonyddwch mecanyddol (Atodol Ffig. 1) fod gan y grŵp a gafodd ei drin â LV-AS lefelau sylweddol uwch o drawsgludiad ym mhresenoldeb magnet (Ffig. 9a).Dim ond ychydig bach o staenio LacZ glas oedd yn bresennol yn y grŵp rheoli (Ffigur 9b).Dangosodd meintioli rhanbarthau normaleiddio â lliw X-Gal fod gweinyddu LV-MP ym mhresenoldeb maes magnetig wedi arwain at welliant tua 6 gwaith yn fwy (Ffig. 9c).
Enghraifft o ddelweddau cyfansawdd yn dangos trawsgludiad tracheal ag LV-MP (a) ym mhresenoldeb maes magnetig a (b) yn absenoldeb magnet.(c) Gwelliant ystadegol arwyddocaol yn ardal normaleiddio trawsgludiad LacZ yn y tracea gyda'r defnydd o fagnet (*p = 0.029, t-brawf, n = 3 fesul grŵp, cymedr ± gwall safonol y cymedr).
Niwtral cyflym coch-staenio adrannau (enghraifft a ddangosir yn Atodol Ffig. 2) yn dangos bod LacZ-staenio celloedd yn bresennol yn yr un sampl ac yn yr un lleoliad ag adroddwyd yn flaenorol.
Yr her allweddol mewn therapi genynnau llwybr anadlu o hyd yw union leoliad gronynnau cludo mewn meysydd o ddiddordeb a chyflawni lefel uchel o effeithlonrwydd trawsgludo yn yr ysgyfaint symudol ym mhresenoldeb llif aer a chlirio mwcws gweithredol.Ar gyfer cludwyr LV a fwriedir ar gyfer trin clefydau anadlol mewn ffibrosis systig, mae cynyddu amser preswylio'r gronynnau cludo yn y llwybrau anadlu dargludol wedi bod yn nod anghyraeddadwy hyd yn hyn.Fel y nodwyd gan Castellani et al., mae gan ddefnyddio meysydd magnetig i wella trawsgludiad fanteision dros ddulliau cyflenwi genynnau eraill megis electroporation oherwydd gall gyfuno symlrwydd, economi, darpariaeth leol, mwy o effeithlonrwydd, ac amser deori byrrach.ac o bosibl dogn is o gerbyd10.Fodd bynnag, nid yw dyddodiad in vivo ac ymddygiad gronynnau magnetig yn y llwybrau anadlu o dan ddylanwad grymoedd magnetig allanol erioed wedi'i ddisgrifio, ac mewn gwirionedd nid yw gallu'r dull hwn i gynyddu lefelau mynegiant genynnau mewn llwybrau anadlu byw cyflawn wedi'i ddangos yn vivo.
Dangosodd ein harbrofion in vitro ar y synchrotron PCXI fod yr holl ronynnau a brofwyd gennym, ac eithrio'r polystyren AS, yn weladwy yn y gosodiad delweddu a ddefnyddiwyd gennym.Ym mhresenoldeb maes magnetig, mae meysydd magnetig yn ffurfio llinynnau, y mae eu hyd yn gysylltiedig â'r math o ronynnau a chryfder y maes magnetig (hy, agosrwydd a symudiad y magnet).Fel y dangosir yn Ffigur 10, mae'r llinynnau rydyn ni'n eu harsylwi yn cael eu ffurfio wrth i bob gronyn unigol gael ei fagneteiddio a chymell ei faes magnetig lleol ei hun.Mae'r caeau ar wahân hyn yn achosi gronynnau tebyg eraill i gasglu a chysylltu â symudiadau llinynnol grŵp oherwydd grymoedd lleol o rymoedd lleol atyniad a gwrthyriad gronynnau eraill.
Diagram yn dangos (a, b) cadwyni o ronynnau yn ffurfio y tu mewn i gapilarïau llawn hylif ac (c, ch) tracea llawn aer.Sylwch nad yw'r capilarïau a'r tracea wedi'u lluniadu wrth raddfa.Mae panel (a) hefyd yn cynnwys disgrifiad o'r MF sy'n cynnwys gronynnau Fe3O4 wedi'u trefnu mewn cadwyni.
Pan symudodd y magnet dros y capilari, cyrhaeddodd ongl y llinyn gronynnau y trothwy critigol ar gyfer MP3-5 sy'n cynnwys Fe3O4, ac ar ôl hynny nid oedd y llinyn gronynnau bellach yn aros yn ei safle gwreiddiol, ond symudodd ar hyd yr wyneb i safle newydd.magned.Mae'r effaith hon yn debygol o ddigwydd oherwydd bod wyneb y capilari gwydr yn ddigon llyfn i ganiatáu i'r symudiad hwn ddigwydd.Yn ddiddorol, nid oedd MP6 (CombiMag) yn ymddwyn fel hyn, efallai oherwydd bod y gronynnau'n llai, â gorchudd neu dâl arwyneb gwahanol, neu roedd yr hylif cludo perchnogol yn effeithio ar eu gallu i symud.Mae'r cyferbyniad yn y ddelwedd gronynnau CombiMag hefyd yn wannach, sy'n awgrymu y gallai'r hylif a'r gronynnau fod â'r un dwysedd ac felly na allant symud yn hawdd tuag at ei gilydd.Gall gronynnau hefyd fynd yn sownd os yw'r magnet yn symud yn rhy gyflym, gan nodi na all cryfder y maes magnetig bob amser oresgyn y ffrithiant rhwng gronynnau yn yr hylif, gan awgrymu na ddylai cryfder y maes magnetig a'r pellter rhwng y magnet a'r ardal darged ddod fel a syndod.pwysig.Mae'r canlyniadau hyn hefyd yn dangos, er y gall magnetau ddal llawer o ficroronynnau sy'n llifo trwy'r ardal darged, mae'n annhebygol y gellir dibynnu ar fagnetau i symud gronynnau CombiMag ar hyd wyneb y tracea.Felly, daethom i'r casgliad y dylai astudiaethau in vivo LV MF ddefnyddio meysydd magnetig statig i dargedu ardaloedd penodol o'r goeden llwybr anadlu yn ffisegol.
Unwaith y bydd y gronynnau'n cael eu danfon i'r corff, mae'n anodd eu hadnabod yng nghyd-destun meinwe symudol cymhleth y corff, ond mae eu gallu canfod wedi'i wella trwy symud y magnet yn llorweddol dros y tracea i "wiggle" y llinynnau AS.Er bod delweddu amser real yn bosibl, mae'n haws dirnad symudiad gronynnau ar ôl i'r anifail gael ei ladd yn drugarog.Roedd crynodiadau MP fel arfer ar eu huchaf yn y lleoliad hwn pan osodwyd y magnet dros yr ardal ddelweddu, er bod rhai gronynnau fel arfer i'w canfod ymhellach i lawr y tracea.Yn wahanol i astudiaethau in vitro, ni all gronynnau gael eu llusgo i lawr y tracea gan symudiad magnet.Mae'r canfyddiad hwn yn gyson â sut mae'r mwcws sy'n gorchuddio wyneb y tracea fel arfer yn prosesu gronynnau wedi'u hanadlu, gan eu dal yn y mwcws ac yna eu clirio trwy'r mecanwaith clirio mwco-ciliary.
Tybiwyd gennym y gallai defnyddio magnetau uwchben ac o dan y tracea ar gyfer atyniad (Ffig. 3b) arwain at faes magnetig mwy unffurf, yn hytrach na maes magnetig sy'n gryno iawn ar un adeg, gan arwain o bosibl at ddosbarthiad mwy unffurf o ronynnau..Fodd bynnag, ni chanfu ein hastudiaeth ragarweiniol dystiolaeth glir i gefnogi'r ddamcaniaeth hon.Yn yr un modd, ni arweiniodd gosod pâr o fagnetau i wrthyrru (Ffig. 3c) at fwy o ronynnau'n setlo yn ardal y ddelwedd.Mae'r ddau ganfyddiad hyn yn dangos nad yw'r gosodiad magnet deuol yn gwella rheolaeth leol pwyntio AS yn sylweddol, a bod y grymoedd magnetig cryf o ganlyniad yn anodd eu tiwnio, gan wneud y dull hwn yn llai ymarferol.Yn yr un modd, nid oedd cyfeiriadu'r magnet uwchben ac ar draws y tracea (Ffigur 3d) ychwaith yn cynyddu nifer y gronynnau sy'n weddill yn yr ardal ddelwedd.Efallai na fydd rhai o'r ffurfweddau amgen hyn yn llwyddiannus gan eu bod yn arwain at ostyngiad yng nghryfder y maes magnetig yn y parth dyddodiad.Felly, ystyrir mai'r ffurfweddiad magnet sengl ar 30 gradd (Ffig. 3a) yw'r dull profi in vivo symlaf a mwyaf effeithlon.
Dangosodd astudiaeth LV-MP, pan gyfunwyd fectorau LV â CombiMag a'u cyflwyno ar ôl cael eu haflonyddu'n gorfforol ym mhresenoldeb maes magnetig, cynyddodd lefelau trawsgludiad yn sylweddol yn y tracea o'i gymharu â rheolaethau.Yn seiliedig ar astudiaethau delweddu synchrotron a chanlyniadau LacZ, roedd yn ymddangos bod y maes magnetig yn gallu cadw'r LV yn y tracea a lleihau nifer y gronynnau fector a dreiddiodd yn ddwfn i'r ysgyfaint ar unwaith.Gall gwelliannau targedu o'r fath arwain at effeithlonrwydd uwch tra'n lleihau teitrau a ddarperir, trawsgludiad heb ei dargedu, sgîl-effeithiau llidiol ac imiwn, a chostau trosglwyddo genynnau.Yn bwysig, yn ôl y gwneuthurwr, gellir defnyddio CombiMag mewn cyfuniad â dulliau trosglwyddo genynnau eraill, gan gynnwys fectorau firaol eraill (fel AAV) ac asidau niwclëig.