Mae Giardia duodenum yn organeb barasitig sy'n achosi giardiasis, haint berfeddol sy'n arbennig o gyffredin mewn plant ifanc ag arwyddion clinigol o ddolur rhydd.Rydym wedi adrodd yn flaenorol bod G. duodenalis allgellog yn sbarduno actifadu niwcleotidau rhwymo derbynnydd tebyg i oligomeriad 3 (NLRP3) mewngellol ac yn rheoleiddio ymatebion llidiol lletyol trwy secretiad fesigl allgellog (EV).Fodd bynnag, mae union batrymau moleciwlaidd yr EV dwodenococol (GEV) sy'n gysylltiedig â phathogenau sy'n rhan o'r broses hon a rôl llidus NLRP3 mewn giardiasis yn parhau i gael eu hegluro.
Adeiladwyd plasmidau mynegiant ewcaryotig ailgyfunol pcDNA3.1(+)-alpha-2 ac alffa-7.3 giardinau mewn GEV, eu trawsosod yn macroffagau peritoneol cynradd llygoden, a'u canfod trwy fesur y moleciwl targed llid caspase-1.Sgriniwyd lefel mynegiant t20..Nodwyd G. duodenalis alpha-2 ac alffa-7.3 giardines yn wreiddiol trwy fesur NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 a caspase-1 p20), secretion IL.Lefelau 1β, lefelau oligomerization protein smotiog apoptotig (ASC), a lleoleiddio immunofluorescent NLRP3 ac ASC.Yna aseswyd rôl yr inflammasome NLRP3 yn bathogenedd G. duodenalis gan ddefnyddio llygod lle cafodd actifadu NLRP3 ei rwystro (llygod wedi'i rwystro gan NLRP3) a monitro newidiadau patholegol ym mhwysau'r corff, llwyth parasitig dwodenol, a meinwe dwodenol.Yn ogystal, gwnaethom ymchwilio i weld a yw hiardines alffa-2 ac alffa-7.3 yn achosi secretiad IL-1β in vivo trwy'r inflammasome NLRP3 a phenderfynwyd rôl y moleciwlau hyn yn pathogenedd G. duodenalis mewn llygod.
Mae giardinau Alpha-2 ac alffa-7.3 yn ysgogi actifadu'r inflammasome NLRP3 in vitro.Arweiniodd hyn at actifadu p20 caspase-1, cynnydd yn lefelau mynegiant NLRP3, pro-IL-1β, a phroteinau pro-caspase-1, cynnydd sylweddol mewn secretion IL-1β, ffurfio smotiau ASA yn y cytoplasm, ac ymsefydlu oligomerization ASA.Llid NLRP3 Mae colled penile yn gwaethygu pathogenedd G. duodenalis mewn llygod.Roedd llygod a gafodd eu trin â systiau â gavage o lygod wedi'u rhwystro gan NLRP3 yn arddangos nifer cynyddol o trophozoites a difrod difrifol i'r fili dwodenol, a nodweddir gan crypts necrotig gyda chrebachu a changhennog.Mae arbrofion in vivo wedi dangos y gall giardines alffa-2 ac alffa-7.3 achosi secretiad o IL-1β trwy'r inflammasome NLRP3, ac mae imiwneiddio â giardines alffa-2 ac alffa-7.3 yn lleihau pathogenedd G. duodenalis mewn llygod.
Gyda'i gilydd, mae canlyniadau'r astudiaeth hon yn awgrymu bod giardia alffa-2 ac alffa-7.3 yn achosi dadreoleiddio llid NLRP3 gwesteiwr a lleihau heintiad G. duodenalis mewn llygod, sy'n dargedau addawol ar gyfer atal giardiasis.
Mae Giardia duodenum yn barasit protosoaidd allgellog sy'n byw yn y coluddyn bach ac yn achosi 280 miliwn o achosion o giardiasis â dolur rhydd yn flynyddol, yn enwedig ymhlith plant ifanc mewn gwledydd sy'n datblygu [1].Mae pobl yn cael eu heintio gan ddŵr yfed neu fwyd wedi'i halogi â systiau M. duodenwm, sydd wedyn yn mynd i mewn i'r stumog ac yn cael eu hysgarthu yn y sudd gastrig.Mae trozooites Giardia duodenum yn glynu wrth yr epitheliwm dwodenol, gan achosi cyfog, chwydu, dolur rhydd, poen yn yr abdomen, a cholli pwysau.Mae unigolion â diffyg imiwnedd a ffibrosis systig yn agored i haint.Gall haint hefyd ddigwydd trwy ryw geneuol a rhefrol [2].Cyffuriau fel metronidazole, tinidazole, a nitazoxanide yw'r opsiynau triniaeth a ffefrir ar gyfer heintiau dwodenol [3].Fodd bynnag, mae'r cyffuriau cemotherapi hyn yn achosi sgîl-effeithiau andwyol megis cyfog, carcinogenesis, a genowenwyndra [4].Felly, mae angen datblygu strategaethau mwy effeithiol i atal haint G. duodenalis.
Mae inflammasomes yn ddosbarth o gyfadeiladau protein cytosolig sy'n rhan o'r ymateb imiwn cynhenid, gan helpu i amddiffyn rhag goresgyniad pathogen a chyfryngu ymatebion llidiol [5].Ymhlith y inflammasomes hyn, mae oligomerization rhwymo niwcleotid oligomerization (NOD) derbynnydd 3 (NLRP3) oligomerization rhwymo niwcleotid (NLRP3) tebyg i niwcleotid-rhwymo inflammasome tebyg i niwcleotid wedi'i astudio'n helaeth oherwydd gellir ei ganfod gan wahanol batrymau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â phathogenau / difrod (PAMP / DAMP), yn cydnabod, yn actifadu'r system imiwnedd gynhenid.ac yn rheoleiddio homeostasis berfeddol mewn llawer o glefydau llidiol [6,7,8].Mae'n cynnwys y derbynnydd adnabod patrwm (PRR) NLRP3, addasydd protein smotiog apoptotig (ASC), ac effeithydd procaspase-1 neu procaspase-11.Mae'r inflammasome NLRP3 yn gweithredu fel gwesteiwr yn erbyn goresgyniad pathogen, fel y gwelwyd yn Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], ac astudiaethau Leishmania.[11], ond adroddwyd hefyd bod actifadu'r inflammasome NLRP3 yn cyfyngu ar ymatebion imiwn amddiffynnol ac yn gwaethygu dilyniant clefydau, er enghraifft, mewn mwydod [12].Yn seiliedig ar ein canfyddiadau blaenorol, fe wnaethom adrodd bod G. duodenalis allgellog yn sbarduno actifadu mewngellol o lid NLRP3 ac yn modiwleiddio ymatebion llidiol gwesteiwr trwy gyfrinachu fesiglau allgellog (EVs) [13].Fodd bynnag, mae rôl llidus NLRP3 mewn haint G. duodenalis in vivo i'w benderfynu o hyd.
Disgrifiwyd Giardins yn wreiddiol fel cydrannau strwythurol y cytoskeleton G. duodenalis ac maent yn chwarae rhan bwysig mewn symudoldeb trozooite ac ymlyniad celloedd epithelial yn y coluddyn bach.Er mwyn addasu'n well i'r amgylchedd a chynyddu eu pathogenedd, datblygodd G. trophozoites duodenalis strwythur cytoskeletal unigryw sy'n cynnwys 8 flagella, 1 corff canol, ac 1 disg fentrol [14].Mae trofozoites Giardia duodenum yn defnyddio eu cytoskeleton i dreiddio i'r coluddyn bach uchaf, yn enwedig y dwodenwm, ac yn glynu wrth enterocytes.Maent yn mudo'n gyson ac yn glynu wrth gelloedd epithelial gan ddefnyddio metaboledd celloedd.Felly, mae perthynas agos rhwng eu cytoskeleton a ffyrnigrwydd.Mae giardines sy'n benodol ar gyfer Giardia duodenum yn gydrannau o'r strwythur cytoskeleton [15] ac fe'u rhennir yn bedwar dosbarth: α-, β-, γ-, a δ-giardines.Mae 21 aelod o'r teulu α-giardin, ac mae gan bob un ohonynt allu sy'n ddibynnol ar galsiwm i rwymo ffosffolipidau [16].Maent hefyd yn cysylltu'r sytosgerbwd i'r gellbilen.Mewn unigolion â dolur rhydd a achosir gan G. duodenalis, mae α-giardins yn cael eu mynegi'n fawr ac yn immunoreactive yn ystod haint [17].Mae brechlynnau heterologaidd yn seiliedig ar Giardia alfa-1 wedi'u diogelu rhag giardiasis mewn llygod ac maent yn ddarpar antigenau posibl ar gyfer datblygu brechlyn [18].Mae Alpha-8 giardin, wedi'i leoli yn y bilen plasma a flagella, ond nid yn y disg fentrol, yn gwella symudoldeb a chyfradd twf trozooites yn G. duodenalis [19].Mae Alpha-14 giardin yn atodi i strwythurau microtubule ar flagella ac yn effeithio ar hyfywedd G. duodenalis [20].Mae Alpha-11 giardine yn bresennol yn helaeth trwy gydol y cylch bywyd, ac mae gorfynegiant giardine alffa-11 yn niweidio G. duodenalis ei hun [21].Fodd bynnag, nid yw'n glir a yw giardine alffa-2 ac alffa-7.3 giardine yn amddiffyn rhag haint G. duodenalis a'u mecanweithiau sylfaenol.
Yn yr astudiaeth hon, trosglwyddwyd plasmidau mynegiant ewcaryotig ailgyfunol pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine a pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine i mewn i macroffagau peritoneol cynradd llygoden i actifadu gwesteiwr NLRP3.Yna cafodd targedau llidus eu sgrinio.Fe wnaethom hefyd asesu rôl llidus NLRP3 yn bathogenedd G. duodenalis, ymchwilio i weld a yw giardîns alffa-2 ac alffa-7,3 yn ysgogi actifadu'r llidus NLRP3 in vivo, a phenderfynu bod y ddwy rôl hyn o giardinau yn pathogenedd o G. duodenalis.Ein nod cyffredin oedd datblygu targedau addawol ar gyfer atal haint G. duodenalis.
Prynwyd math gwyllt (WT) C57BL/6 llygod benywaidd 5-8 wythnos oed o Ganolfan Anifeiliaid Arbrofol Liaoning Changsheng (Liaoning, Tsieina).Roedd gan lygod fynediad am ddim i ddŵr, roeddent yn derbyn bwyd wedi'i sterileiddio ac yn cael eu cadw mewn cylch golau/tywyll 12/12 awr.Cyn haint, derbyniodd llygod wrthfiotigau ad libitum mewn dŵr yfed wedi'i ategu ag ampicillin (1 mg / mL), vancomycin (1 mg / mL), a neomycin (1.4 mg / mL) (pob un wedi'i brynu o Shanghai, Tsieina, organebau artiffisial) [ 22 ].].Cafodd llygod a gollodd y gallu i fwyta ac yfed am > 24 awr ac a gollodd ≥ 20% o bwysau'r corff eu lladd yn drugarog gan ddadleoliad ceg y groth.
Ychwanegwyd trophozoites WB G. duodenalis (Casgliad Diwylliant Math Americanaidd, Manassas, UDA) â serwm buchol ffetws 12.5% ​​(FBS; Every Green, Zhejiang, China) a 0.1% bustl buchol (Sigma-Aldrich, St. Missouri, UDA ).UDA) o dan amodau microaerobig.Casglwyd trofosoitau cydlifol ar iâ a'u cludo ar gymhareb o 1:4 i'w hatgynhyrchu ymhellach.
Anwythwyd codennau duodenwm Giardia fel y disgrifiwyd yn flaenorol [23], cynaeafwyd trophozoites yn y cyfnod logarithmig ac yna eu gwanhau gyda chyfrwng ysgogi amgapsiwleiddio, pH 7.1 (TYI-S-33 wedi'i addasu) i grynodiad terfynol o 1 × 106 trophozoites / mL.crynodiad bustl 0.05% canolig).Roedd troffozoites yn cael eu meithrin o dan amodau anaerobig ar 37°C tan y cyfnod twf logarithmig.Newid y cyfrwng i gyfrwng ysgogi syst (pH 7.8; cyfrwng TYI-S-33 wedi'i addasu gyda chrynodiad bustl o 1%) a meithriniad G. duodenalis ar 37 ° C am 48-96 awr, pan welwyd y codennau ffurfio o dan ficrosgop.Ar ôl i'r rhan fwyaf o'r trofosoitiaid gael eu hysgogi i ffurfio codennau, cynaeafwyd y cymysgedd meithrin a'i ail-ddal mewn dŵr di-ïoneiddiedig di-haint i lyse'r trofosoitau oedd ar ôl.Roedd codennau'n cael eu cyfrif a'u storio ar 4°C ar gyfer dadansoddiadau dilynol trwy diwb gastrig mewn llygod.
Cyfoethogwyd fesiglau allgellog Giardia (GEVs) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [13].Cafodd troffozoites yn y cyfnod twf logarithmig eu hailddarparu mewn cyfrwng TYI-S-33 wedi'i addasu a baratowyd gyda FBS wedi'i ddisbyddu'n ecsosomaidd (Diwydiannau Biolegol, Beit-Haemek, Israel) i grynodiad terfynol o barasitiaid 1 × 106 / ml a'u deor am 12 awr.wedi'u hynysu o'r supernatant diwylliant trwy allgyrchu ar 2000 g am 10 munud, 10,000 g am 45 munud, a 100,000 g am 60 munud.Cafodd gwaddodion eu toddi mewn halwynog wedi'i glustogi ffosffad (PBS), eu mesur gan ddefnyddio pecyn profi protein BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) a'u storio ar -80 ° C. neu eu defnyddio'n uniongyrchol ar gyfer dadansoddiadau pellach.
Paratowyd macroffagau peritoneol llygoden cynradd fel y disgrifiwyd yn flaenorol [24].Yn fyr, cafodd llygod (6-8 wythnos oed) eu chwistrellu (mewnperitoneally [ip]) gyda 2.5 ml o 2.98% cyfrwng thioglycol hylif Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, UDA) a bwydo 3-4 taflod.Casglwyd ataliad o macroffagau o geudod abdomenol llygod ar ôl ewthanasia a'i allgyrchu 3 gwaith ar 1000 g am 10 munud.Canfuwyd celloedd wedi'u cynaeafu gan cytometreg llif gan ddefnyddio'r marciwr CD11b nes bod purdeb celloedd yn > 98%, yna'n cael eu hychwanegu at blatiau meithrin celloedd 6-ffynnon (4.5 x 106 cell / ffynnon) a'u deor â 10% FBS (Bio-ddiwydiant) ar 37 ° C.a 5% CO2.
Echdynnwyd RNA o trophozoites 1 × 107 mewn 1 ml o adweithydd TRIzol (Vazyme, Nanjing, Tsieina), echdynnwyd DNA genomig o gyfanswm G. duodenalis RNA gan ddefnyddio MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Tsieina) a syntheseiddiwyd DNA cyflenwol (cDNA) defnyddio MonScript RTIIII Super Mix (Monad) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Cafwyd gwybodaeth dilyniant CDS ar gyfer y genyn G. duodenalis targed gan GenBank NCBI.Defnyddiwch Primer 5.0 i ddylunio paent preimio clonio di-dor penodol ar gyfer pob genyn targed.Mae'r preimiwr blaen (5′-3′) yn cynnwys tair rhan: dilyniant sy'n gorgyffwrdd â fector llinol pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) a chodonau cychwyn ATG a GNN (os nad G yw'r sylfaen gyntaf).Gwneir hyn i wella effeithlonrwydd y mynegiant.Yn ogystal, o leiaf 16 bp basau cyfunol (cynnwys GC 40-60%/Tm tua 55 °C).Mae'r paent preimio cefn (5′-3′) yn cynnwys dwy ran, sef dilyniant sy'n gorgyffwrdd â fector llinol EcoRV pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) a sylfaen gyfunol o 16 bp o leiaf.(ac eithrio'r ddau stop olaf).bas) codon fel AA neu GA i alluogi plasmidau ailgyfunol i fynegi eu proteinau wedi'u labelu).Rhestrir y dilyniannau paent preimio yn Nhabl 1 a chawsant eu syntheseiddio gan Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Tsieina).
Mwyhawyd targedau gan ddefnyddio Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) neu Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) gan ddefnyddio G. duodenalis cDNA parod fel templed.Cafodd y fector mynegiant ewcaryotig plasmid pcDNA3.1 (+) ei linellu â'r ensym cyfyngu EcoRV a'i ddadffosfforyleiddio gan ddefnyddio Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Cafodd darnau pcDNA3.1(+) llinol a darnau genynnau targed chwyddedig eu puro gan ddefnyddio pecyn puro gel DNA (Tiangen) a'u mesur gan ddefnyddio Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Ailgyfunwyd y darn pcDNA3.1 (+) a phob darn genyn targed gan ddefnyddio cymysgedd clonio cynulliad sengl MonClone (Monad Biotech Co, Ltd., Suzhou, Tsieina) a'u cadarnhau trwy ddilyniannu DNA gan ddefnyddio Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Cynhyrchwyd plasmidau di-endotocsin pcDNA3.1(+)-alpha-2 a pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 gan ddefnyddio Pecyn Bach Plasmid Di-endocsin SanPrep (Sangon Biotech).Cadwyd y crynodiad yn uwch na 500 ng/µl i sicrhau nad oedd yr EDTA yn y byffer elution yn ymyrryd â'r asesiad trawsgludiad.Cafodd macroffagau peritoneol cynradd eu meithrin mewn platiau 6-ffynnon gyda chyfrwng RPMI 1640 cyflawn (Diwydiannau Biolegol) am 12 awr, yna golchwyd y celloedd 3 gwaith mewn PBS cynnes i gael gwared ar benisilin a streptomycin, ac yna mewn cyfrwng wedi'i ategu â chyfrwng cyflawn.Cafodd plasmidau di-endotocsin pcDNA3.1(+)-alpha-2 a pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) eu gwanhau mewn 125 μl o gyfrwng serwm gostyngol Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Yna cafodd 5 µl o adweithydd transfection Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ei wanhau mewn 125 µl o gyfrwng Opti-MEM serwm isel.Paratowch gyfadeiladau liposome-DNA trwy gymysgu'r plasmid di-endotocsin gwanedig â Lipofectamine 2000 a chaniatáu i'r cymysgedd sefyll ar dymheredd ystafell am 5 munud.Trosglwyddwch y cymhlygion ar wahân i gelloedd ym mhob ffynnon a chymysgwch yn araf.Ar ôl 4 awr, disodlwyd y cyfrwng diwylliant celloedd â 2 ml o gyfrwng RPMI 1640 cyflawn a pharhawyd â'r diwylliant am 24 awr.Ychwanegwyd cyfrwng meithrin celloedd ffres at y celloedd a'i ddeor am wahanol adegau yn dibynnu ar y dyluniad assay.
Paratowyd samplau protein o supernatants a lysates cell fel y disgrifiwyd yn flaenorol [25].Paramedrau trosglwyddo bilen ar gyfer pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, a His-tag oedd 200 mA/90 min.Ar gyfer interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, UDA), caspase-1 (t20) (Adipogen, y Swistir) a NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, y Swistir) a 1:5000 yn targedu Ei dag (Amylet Scientific, Wuhan, Tsieina) ac β-actin (Proteintech, Wuhan, China).
Perfformiwyd traws-gysylltu â disuccinimide suberate (DSS) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [26].Cafodd celloedd eu golchi 3 gwaith gyda PBS oer a'u gorchuddio'n llwyr â nodwydd 27 medr mewn byffer adwaith ASC 50 µl (pH 8.0) yn cynnwys 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES a 125 mM NaHCO3.Cafodd y gymysgedd ei centrifugio ar 5000 g am 3 munud a phwythwyd y belen gyda 10 µl DSS (25 mM mewn DMSO) a byffer adwaith ASC 40 µl am 30 munud ar 37 ° C.Ar ôl centrifugio ar 5000 g am 10 munud, diddymwyd y belen mewn hydoddiant o 40 µl o glustogiad adwaith ASC a 10 µl o glustogfa llwytho protein 6x (TransGen, Beijing, China), ac yna diffoddwyd yr hydoddiant ar dymheredd ystafell am 15 min., Yna berwi 10 munud.Yna bu samplau protein yn destun blotio Gorllewinol gan ddefnyddio gwrthgyrff gwrth-ASC sylfaenol (Wanleibio, Shenyang, China) ar gymhareb wanhau o 1:500.
Yn dilyn gweithdrefn a ddisgrifiwyd yn flaenorol [13], cynaeafwyd supernatants diwylliant celloedd a phenderfynwyd secretion y cytocine pro-inflammatory IL-1β gan ddefnyddio pecyn llygoden IL-1 Beta ELISA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Trosi gwerthoedd OD450nm i grynodiadau protein gan ddefnyddio cromlin safonol IL-1β.
Roedd celloedd wedi'u gorchuddio ar orchuddion yn cael eu golchi'n ysgafn 3 gwaith mewn PBS cynnes, wedi'u gosod mewn sefydlogydd celloedd meinwe (Biosharp, Beijing, Tsieina) am 10 munud ar dymheredd ystafell (RT), mewn 0.1% Triton X-Permeabilize ar 100 (wedi'i wanhau yn PBS; Biosharp; ) am 20 munud ar dymheredd ystafell a blocio mewn albwmin serwm buchol 5% (mewn PBS) am 2 awr ar dymheredd ystafell.Yna deorwyd celloedd dros nos ar 4°C gyda gwrthgyrff sylfaenol yn erbyn ASC (gwanhad 1:100) neu NLRP3 (gwanhad 1:100), yn y drefn honno, ac IgG gwrth-gwningen gafr wedi'i labelu gan Cy3 (H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, UDA) neu IgG gwrth-lygoden gafr cyfun FITC (1:400; Earthox) dros nos ar 37°C yn y tywyllwch am 1 awr.Cafodd y cnewyllyn eu staenio â Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Tsieina) am 5 munud a'u harsylwi o dan ficrosgop fflworoleuedd (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Rhannwyd llygod yn bedwar grŵp (n = 7 ym mhob grŵp): (i) Grŵp rheoli negyddol wedi'i drin gan PBS (PBS yn unig; gavage 100 µl/llygoden PBS wedi'i ddilyn gan chwistrelliad mewnperitoneol dyddiol 100 µl/llygoden PBS 3 awr yn ddiweddarach)., yn barhaus am 7 diwrnod);(ii) grŵp rheoli negyddol wedi'i drin ag atalydd MCC950 [27] (100 µl/llygoden trwy gavage PBS, 3 awr yn ddiweddarach, gweinyddwyd pwysau corff 10 mg/kg [BW] MCC950 [yn PBS] yn fewnberitonig bob dydd, hyd 7 diwrnod);(iii) Grŵp heintiad sys G. duodenalis (1.5 x 106 codennau/llygoden trwy gavage, 3 awr yn ddiweddarach, 100 μl/llygoden PBS yn cael ei weinyddu'n fewnperitoneol bob dydd am 7 diwrnod);(iv) Grŵp heintiau cyfun codennau G. duodenalis Grŵp triniaeth atalydd MCC950 (1.5 × 106 codennau/llygoden drwy gavage, pwysau corff 10mg/kg MCC950 yn fewnperitoneol bob dydd am 7 diwrnod am 3 awr).Roedd pwysau corff pob llygoden yn cael ei fonitro'n ddyddiol ac roedd pob llygod yn cael eu ewthaneiddio ar y 7fed diwrnod.Cafodd dwodenwm wedi'i gynaeafu (3 cm o hyd) ei dorri'n ddarnau bach mewn 1 ml PBS, dinistriwyd codennau dros nos yn PBS ar 4°C, a G. duodenalis trophozoites.Cafodd dwodenwm ffres (1 cm o hyd) ei ynysu ar gyfer staenio hematocsilin ac eosin (H&E).
Rhannwyd llygod yn ddau grŵp: (i) grŵp rheoli ffug a (ii) grŵp atalyddion MCC950.Roedd pum triniaeth ym mhob grŵp (n = 7/grŵp triniaeth): (i) grŵp rheoli negyddol triniaeth PBS (PBS yn unig; 100 µl/llygoden PBS, pigiad mewngyhyrol (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) grŵp rheoli plasmid negatif (DNA 100 µg/llygoden, trwy chwistrelliad mewngyhyrol); (iii) grŵp rheoli positif ar gyfer heintiad sys duodenalis (1.5 x 106 codennau/llygoden, trwy gavage) (iv) a grŵp wedi'i drin â plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/DNA llygoden, trwy chwistrelliad mewngyhyrol), a (v) grŵp wedi'i drin â plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/llygoden DNA, ar ôl 12 awr o daith, roedd llygod yn y grŵp atalyddion MCC950 yn derbyn pigiad mewnperitoneol dyddiol o MCC950 (10 mg/kg pwysau corff) am 7 diwrnod, tra bod llygod yn y grŵp MOCK yn derbyn cyfaint cyfartal o driniaeth PBS. Roedd samplau gwaed yn a gasglwyd o lygod peli'r llygad a'u gadael dros nos ar 4 ° C. Cafodd samplau serwm eu hynysu gan ddefnyddio assay immunosorbent sy'n gysylltiedig ag ensymau (ELISA) ar gyfer a mesuriadau o lefelau IL-1β.
Rhannwyd tri deg pump o lygod yn bum grŵp (n=7/grŵp).Roedd Grŵp 1 yn grŵp rheoli negyddol a gafodd ei drin â PBS: derbyniodd llygod 100 μl o PBS yn fewngyhyrol a 3 diwrnod yn ddiweddarach trwy fesurydd.Mae Grŵp 2 yn grŵp rheoli positif sydd wedi'i heintio â systiau G. duodenalis: chwistrellwyd llygod â 100 μl o PBS, a 3 diwrnod yn ddiweddarach chwistrellwyd 1.5 x 106 o godennau/llygoden yn fewn-gastig.Trydydd grŵp – imiwneiddio plasmid gyda pcDNA3.1(+) mewn cyfuniad â grŵp rheoli ar gyfer haint syst dwodenol: derbyniodd llygod 100 μg o DNA plasmid pcDNA3.1(+)(im) ar lafar, codennau 1.5 × 106/llygoden 3 ar gyfer sawl un dyddiau.Roedd grwpiau 4 a 5 yn ailgyfunol pcDNA3.1 (+)-alpha-2 giardine plasmid neu pcDNA3.1 (+)-alpha-7.3 giardine plasmid mewn cyfuniad â haint G. duodenalis cyst.Grŵp arbrofol: derbyniodd llygod 100 µg o pcDNA3.DNA plasmid 1(+)-giardine (im), yna 3 diwrnod yn ddiweddarach, chwistrellwyd 1.5 × 106 o goden/llygoden drwy gavage.Cafodd pwysau corff pob llygoden ei fonitro ar ôl cyflwyno cyst G. duodenalis drwy'r tiwb.Casglwyd dwodenwm ffres ar gyfer mesuriadau llwyth parasitig a dadansoddiad staen AU.
Dadansoddwyd newidiadau histopatholegol yn unol â gweithdrefn a gyhoeddwyd yn flaenorol [30].Gosodwyd dwodenwm ffres gyda sefydlogydd celloedd meinwe, wedi'i fewnosod mewn paraffin, wedi'i dorri'n adrannau 4 μm, wedi'i staenio â H&E a'i ddadansoddi o dan ficrosgop golau.Gwerthuswyd newidiadau patholegol cynrychioliadol mewn saith adran feinwe o saith llygod annibynnol gan batholegydd nad oedd yn ymwybodol o'r driniaeth a chawsant eu dal ar chwyddhad 200x.Mesurwyd hyd y villi a dyfnder y crypts yn unol â'r dulliau a ddisgrifiwyd yn flaenorol.
Cafwyd canlyniadau in vitro ac in vivo yn driphlyg.Cynhyrchwyd graffiau gan ddefnyddio GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, UDA).Dadansoddwyd gwahaniaethau rhwng dau grŵp yn ôl prawf-t, tra dadansoddwyd gwahaniaethau rhwng grwpiau ≥3 trwy ddadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) gan ddefnyddio meddalwedd SPSS (fersiwn 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, UDA).Dadansoddwyd data ar gyfer homogenedd amrywiant gan ddefnyddio prawf Levene ac yna prawf post hoc Bonferroni (B).Mynegir arwyddocâd fel P<0.05, P<0.01, a P<0.001 (ddim yn arwyddocaol [ns]) (P>0.05).
Dangosodd ein dadansoddiad blaenorol o broteomeg GEV yn Gwyddoniadur Genynnau a Genomau Kyoto (KEGG) y gallai llawer o dargedau fod yn rhan o actifadu llwybrau signalau llidiol [13].Dewisom ddau darged addawol, giardinau alffa-2 ac alffa-7.3, mwyhau'r moleciwlau hyn a'u defnyddio i adeiladu fector mynegiant ewcaryotig pcDNA3.1(+).Ar ôl dilyniannu, trosglwyddwyd plasmidau mynegiant pcDNA3.1 (+)-alpha-2 ailgyfunol ac alffa-7.3 giardine i mewn i macroffagau peritoneol llygoden cynradd, a nodwyd y protein caspase-1 p20 llofnod llid (darn o caspase-1 actifedig) fel egluro moleciwlau allweddol a all sbarduno llid.Dangosodd y canlyniadau y gall giardîns alffa-2 ac alffa-7.3 gymell mynegiant caspase-1 p20 tebyg i GEV.Ni ddarganfuwyd unrhyw effaith ar actifadu caspase-1 yn y rheolaeth negyddol heb ei drin (PBS yn unig) a rheolaeth plasmid pcDNA3.1 (+) (Ffigur 1).
Mesur actifadu caspase-1 p20 gan pcDNA3.1(+)-alpha-2 ac alffa-7.3 giardins.Trawsnewidiwyd plasmidau mynegiant ewcaryotig ailgyfunol pcDNA3.1(+)-alpha-2 ac alffa-7.3 giardîns (uwchben pob lôn) i mewn i macroffagau peritoneol llygoden cynradd a chynaeafwyd supernatants diwylliant 24 awr yn ddiweddarach.Defnyddiwyd blotio gorllewinol i fesur lefelau mynegiant y protein inflammasome caspase-1 p20 llofnod.Defnyddiwyd y grŵp triniaeth PBS yn unig (lôn C) a'r grŵp monotherapi pcDNA3.1 (+) (lôn pcDNA3.1) fel rheolaeth negyddol, a defnyddiwyd y grŵp triniaeth GEV fel rheolaeth gadarnhaol.Cadarnhawyd mynegiant y protein ailgyfunol trwy ganfod tag histidine ym mhob protein, a'r bandiau protein disgwyliedig oedd giardine alffa-2 (38.2 kDa) ac alffa-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, fesiglau allgellog Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), fector llinol EcoRV, SUP, supernatant
Er mwyn penderfynu a yw giardine alffa-2 ac alffa-7.3 giardine yn cymell mynegiant p20 caspase-1 ac yn chwarae rôl wrth actifadu ymateb llidiol NLRP3 y gwesteiwr, pcDNA3.1 (+)-alpha-2 giardine a pcDNA3.1 (+) -alpha Trosglwyddwyd -7.3 giardin i mewn i macroffagau peritoneol llygoden cynradd gyda DNA plasmid ailgyfunol, a phennwyd lefelau mynegiant, lleoleiddio, ac oligomerization y proteinau llidiol allweddol NLRP3.Yn yr arbrawf hwn, defnyddiwyd GEV fel y grŵp rheoli positif, a'r grŵp dim triniaeth (PBS yn unig) neu'r grŵp triniaeth trawsgludiad pcDNA3.1 (+) oedd y grŵp negyddol.Dangosodd y canlyniadau, fel yn y grŵp GEV, fod DNA plasmid ailgyfunol o giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 a giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 wedi arwain at upregulation NLRP3, pro-IL-1β a actifadu procaspase-1 a caspase-1 (Ffig. 2a).Yn ogystal, ysgogodd y ddau giardine secretiad IL-1β sylweddol (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; giardine alffa-2: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alffa-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Ffigur 2b).Roedd y rhan fwyaf o broteinau ASC yn fonomerig yn y grŵp dim triniaeth neu yn y grŵp triniaeth a drosglwyddwyd gyda'r plasmid pcDNA3.1 (+), mewn cyferbyniad â pcDNA3.1 (+)-alpha-2 neu pcDNA3.1 (+)-alpha- 7.3 giardine.Digwyddodd oligomeriad ASC yn DNA plasmid ailgyfunol y grŵp neu grŵp rheoli positif GEV, gan ddangos ffurf oligomeric (Ffigur 2c).Mae'r data rhagarweiniol hyn yn awgrymu y gall giardine alffa-2 ac alffa-7,3 giardine gymell actifadu llid NLRP3.Dangosodd astudiaethau immunofluorescent dilynol o leoleiddio ASC a NLRP3, yn y grŵp rheoli negyddol, fod y protein ASC wedi'i wasgaru trwy'r cytoplasm ac yn ymddangos fel signal dot ar ysgogi pcDNA3.1 (+)-alpha-2 gyda giardine neu pcDNA3.1(+)-alpha-7,3 grŵp giardine neu grŵp rheoli positif GEV (Ffigur 2d).Yn y grwpiau rheoli negyddol a pcDNA 3.1 wedi'u trin â phlasmid, ni chanfuwyd signal protein NLRP3, tra bod dot signal fflwroleuol mewn ymateb i pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine neu pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 ei ganfod..ceir giardine yn y cytoplasm neu wrth ysgogi'r HEV (Ffig. 2e).Mae'r data hyn yn dangos ymhellach fod G. duodenalis giardin alpha-2 a giardin alpha-7.3 yn actifadu'r llidus NLRP3 mewn macroffagau peritoneol cynradd llygoden.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin actifadu'r inflammasome NLRP3 mewn macroffagau peritoneol llygoden.Trawsnewid y mynegiant ewcaryotig ailgyfunol plasmidau pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin i mewn i macroffagau peritoneol cynradd murine a chelloedd, neu cynaeafu'r supernatant o fewn 24 h ar gyfer dadansoddi mynegiant, oligomerization , secretion.a lleoleiddio proteinau llidiol allweddol.Defnyddiwyd y grŵp PBS-yn-unig (C) a'r grŵp triniaeth sengl pcDNA3.1 (+) fel y rheolaeth negyddol, a defnyddiwyd y grŵp triniaeth GEV fel y grŵp cadarnhaol.a Canfuwyd proteinau llidiol allweddol NLRP3, gan gynnwys NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, a p20 caspase-1, gan blotio Gorllewinol.b Pennwyd lefelau secretion IL-1β yn y supernatants gan ddefnyddio assay imiwnosorbent sy'n gysylltiedig ag ensymau (ELISA).Dadansoddwyd gwahaniaethau rhwng grwpiau rheoli a grwpiau arbrofol trwy ddadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) gan ddefnyddio meddalwedd SPSS fersiwn 22.0.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol rhwng grwpiau **P<0.01 a ***P<0.001.c Pennwyd lefelau oligomerization ASC mewn pelenni gan ddadansoddiad trawsgysylltu DSS, tra bod lefelau ASC mewn lysadau celloedd yn cael eu defnyddio fel rheolydd llwytho.d Delweddu lleoleiddio ISC gan ddefnyddio imiwnfflworoleuedd.d Defnyddiwyd imwnofluorescence i ddelweddu lleoleiddio NLRP3.ASC, protein tebyg i brycheuyn apoptotig;IL, rhyngleukin ;NLRP3, niwcleotid-rhwymo oligomerization tebyg i dderbynnydd 3;ns, ddim yn arwyddocaol (P > 0.05)
Mae G. duodenalis a'r GEVs y mae'n eu secretu yn actifadu'r NLRP3 inflammasome ac yn rheoleiddio ymatebion llidiol y gwesteiwr in vitro.Felly, mae rôl yr inflammasome NLRP3 yn pathogenedd G. duodenalis yn parhau i fod yn aneglur.Er mwyn ymchwilio i'r mater hwn, gwnaethom gynllunio arbrawf rhwng llygod sydd wedi'u heintio â cyst G. duodenalis a llygod sydd wedi'u heintio â thriniaeth atalydd G. duodenalis cyst + MCC950 a chymharu mynegiant inflammasome NLRP3 pan gafodd ei heintio â cyst G. duodenalis.Dangosir cynllun manwl o'r arbrawf yn Ffig. 3a.Cafodd newidiadau ym mhwysau corff llygod mewn gwahanol grwpiau triniaeth eu monitro am 7 diwrnod ar ôl cael eu heintio â systiau, a dangosir y canlyniadau yn Ffig. 3b.O'i gymharu â'r grŵp a gafodd ei drin â PBS pur, dangosodd y canlyniadau (i) bod pwysau corff llygod sydd wedi'u heintio â cyst G. duodenalis wedi gostwng o ddiwrnod 3 i ddiwrnod 7 ar ôl haint;(ii) ni chafodd triniaeth ag atalydd MCC950 unrhyw effaith arwyddocaol ar bwysau corff y llygod..O'i gymharu â'r grŵp heintiau sengl, gostyngodd BW y grŵp haint dwodenol a gafodd ei drin â MCC950 i raddau amrywiol (Diwrnod 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Diwrnod 2: ANOVA, F ( 3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; Diwrnod 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; Diwrnod 4: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Diwrnod 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; Diwrnod 7: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202).Mae'r data hyn yn dangos bod y inflammasome NLRP3 yn amddiffyn llygod rhag colli pwysau sylweddol yn ystod camau cynnar (2-4 diwrnod) haint dwodenol.Yna anelwyd at ganfod trofosoitau G. duodenalis mewn hylif lavage dwodenol a dangosir y canlyniadau yn Ffigur 3c.O'i gymharu â grŵp heintiad cyst G. duodenalis, cynyddodd nifer y trozooites yn y duodenwm yn sylweddol ar ôl blocio'r inflammasome NLRP3 (t(12) = 2.902, P = 0.0133).Dangosodd meinweoedd dwodenol wedi'u staenio ag AU, o'u cymharu â rheolaeth negyddol a gafodd ei drin â PBS a MCC950 yn unig: (i) Arweiniodd haint cyst duodenalis at niwed i'r fili dwodenol (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) ac atroffi crypt (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) dwodenwm o lygod sydd wedi'u heintio â systiau G. duodenalis a'u trin ag atalyddion MCC950.difrodwyd fili dwodenol a bu farw (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) gydag atroffi a changhennog crypt (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Ffig. 3d- dd) .Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod yr inflammasome NLRP3 yn chwarae rhan wrth leihau pathogenedd G. duodenalis.
Rôl llidus NLRP3 mewn haint Giardia duodenum.Roedd llygod yn cael eu defnyddio (iv) â systiau dwodenococol ac yna'n cael eu trin gyda MCC950 (ip) neu hebddynt.Defnyddiwyd grwpiau triniaeth sengl gyda PBS neu MCC950 fel rheolaethau.Grŵp arbrofol a threfn driniaeth.b Cafodd pwysau corff llygod ym mhob un o'r grwpiau triniaeth amrywiol ei fonitro am 7 diwrnod.Dadansoddwyd y gwahaniaeth rhwng grŵp haint G. duodenalis a grŵp trin haint G. duodenalis + MCC950 trwy brawf-t gan ddefnyddio fersiwn meddalwedd SPSS 22.0.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol yn *P<0.05, **P<0.01, neu ***P<0.001.c Pennwyd llwyth parasitig trwy gyfrif nifer y trofosoitau mewn hylif lavage dwodenol.Dadansoddwyd y gwahaniaeth rhwng grŵp haint G. duodenalis a grŵp trin haint G. duodenalis + MCC950 trwy brawf-t gan ddefnyddio fersiwn meddalwedd SPSS 22.0.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol ar *P < 0.05.d Canlyniadau staenio hematocsilin ac eosin (H&E) o histopatholeg dwodenol.Mae saethau coch yn dynodi difrod i'r fili, mae saethau gwyrdd yn dynodi difrod i'r crypts.Bar graddfa: 100 µm.e, f Dadansoddiad ystadegol o uchder filws dwodenol ac uchder crypt llygoden.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol yn *P<0.05 a **P<0.01.Daw'r canlyniadau o 7 arbrawf biolegol annibynnol.BW, pwysau corff;ig, llwybr cyflwyno intragastrig;ip, llwybr cyflwyno mewnperitoneol;ns, ddim yn arwyddocaol (P > 0.05);PBS, halwynog byffer ffosffad;WT, math gwyllt
Mae secretion IL-1β yn nodwedd o actifadu llid.Er mwyn penderfynu a yw G. duodenalis alpha-2 giardine ac alffa-7.3 giardine yn actifadu'r llu NLRP3 inflammasome in vivo, fe wnaethom ddefnyddio llygod WT heb eu trin (grŵp ffug) a llygod wedi'u rhwystro rhag llid NLRP3 (grŵp triniaeth ataliedig MCC950).Dangosir cynllun manwl o'r arbrawf yn Ffig. 4a.Roedd grwpiau arbrofol yn cynnwys llygod a gafodd eu trin â PBS, triniaeth codennau G. duodenalis trwy gavage, chwistrelliad mewngyhyrol o pcDNA3.1, a chwistrelliad mewngyhyrol o giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2 neu pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Ar y 7fed diwrnod ar ôl rhoi'r plasmid ailgyfunol yn fewngyhyrol, casglwyd serwm a phenderfynwyd lefel IL-1β ym mhob grŵp.Fel y dangosir yn Ffigur 4b, yn y grŵp MOCK: (i) o'i gymharu â'r grŵp PBS, ni chafodd triniaeth pcDNA3.1 unrhyw effaith sylweddol ar secretion IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), fodd bynnag, Codwyd secretion IL-β yn sylweddol yn y grŵp cyst G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine a pcDNA3.1- Cynyddodd chwistrelliad mewngyhyrol o giardine alffa-7.3 yn sylweddol lefelau serwm IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 a achosir gan giardine lefelau uchel o secretiad IL -1β yn y grŵp pigiad mewngyhyrol giardine pcDNA3.1-alpha-2 (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .O'i gymharu â phob grŵp yn y grŵp triniaeth MCC950 a'r grŵp MOCK: (i) Gostyngodd lefelau secretion IL-1β yn y grŵp rheoli PBS a'r grŵp rheoli pcDNA3.1 i raddau penodol ar ôl blocio'r atalydd MCC950, ond nid oedd y gwahaniaeth arwyddocaol (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) ar ôl blocio MCC950., Gostyngwyd secretion IL-1β yn sylweddol yn y grŵp heintiedig G. duodenalis cyst, y grŵp giardine pcDNA3.1-alpha-2, a'r grŵp giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F (9 , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9, ) = 3.540, P = 0.0164).Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod alffa-2 giardine ac alffa-7.3 giardine yn cyfryngu actifadu'r inflammasome NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines actifadu'r gwesteiwr NLRP3 inflammasome in vivo.Cafodd llygod eu himiwneiddio (IM) gyda mynegiant ewcaryotig ailgyfunol plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine neu pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ac yna eu trin â MCC950 (ip; grŵp MCC950) neu beidio (grŵp ffug ).Defnyddiwyd y grŵp triniaeth plasmid PBS neu pcDNA3.1(+) fel rheolaeth negyddol, defnyddiwyd grŵp trin codennau G. duodenalis fel rheolaeth gadarnhaol.Grŵp arbrofol a threfn driniaeth.b Mesurwyd lefelau serwm o IL-1β mewn llygod ar ddiwrnod 7 gan assay ELISA.Dadansoddwyd y gwahaniaethau rhwng grwpiau yn y grŵp MOCK gan ddefnyddio ANOVA unffordd, a dadansoddwyd gwahaniaethau rhwng y grŵp MOCK a grŵp MCC950 gan ddefnyddio prawf-t fersiwn meddalwedd SPSS 22.0.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol rhwng grwpiau triniaeth yn y grŵp MOCK, *P<0.05 a ***P<0.001;mae arwyddion doler ($) yn dangos gwahaniaethau sylweddol rhwng pob grŵp yn y grŵp MOCK a grŵp MCC950 yn P<0.05.Canlyniadau saith arbrawf biolegol annibynnol.i, pigiad mewngyhyrol, ns, ddim yn arwyddocaol (P > 0.05)
Er mwyn ymchwilio i effaith actifadu alffa-2 ac alffa-7.3 giardine-mediated inflammasome gwesteiwr NLRP3 ar haint G. duodenalis, defnyddiwyd llygod WT C57BL/6 a chwistrellu alffa-2 giardine ac alffa-7.3 giardine.chwistrellwyd y plasmid yn fewngyhyrol, ar ôl 3 diwrnod trwy diwb gastrig y cyst G. duodenalis, ac ar ôl hynny gwelwyd y llygod am 7 diwrnod.Dangosir cynllun manwl o'r arbrawf yn Ffig. 5a.Mesurwyd pwysau corff pob llygoden bob dydd, casglwyd samplau o feinwe dwodenol ffres ar y 7fed diwrnod ar ôl ei roi trwy diwb gastrig, mesurwyd nifer y trozooites, a gwelwyd newidiadau histopatholegol.Fel y dangosir yn Ffigur 5b, gydag amser bwydo cynyddol, cynyddodd BW llygod ym mhob grŵp yn raddol.Dechreuodd y MT o lygod leihau ar y 3ydd diwrnod ar ôl rhoi codennau G. duodenalis mewn-gastrig, ac yna cynyddu'n raddol.Gwnaeth actifadu'r inflammasome NLRP3 a achosir gan chwistrelliad mewngyhyrol o giardine alffa-2 a giardine alffa7.3 wanhau'n sylweddol golled pwysau mewn llygod (Diwrnod 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Diwrnod 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0.9987 Diwrnod 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Diwrnod 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Diwrnod 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083; Diwrnod 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Diwrnod 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Diwrnod 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Diwrnod 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Diwrnod 6: pcDNA3 . giardine alffa-2, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Diwrnod 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Diwrnod 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001 Diwrnod 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0.0001).Aseswyd y llwyth parasitig yn y dwodenwm (Ffig. 5c).O'i gymharu â'r rheolaeth gadarnhaol heb ei drin a'r grŵp wedi'i chwistrellu â'r fector pcDNA3.1 gwag, gostyngwyd nifer y trozooites duodenalis G. yn sylweddol yn y grwpiau a chwistrellwyd â α-2 giardine a α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P <0.0001).Yn ogystal, roedd giardine alfa-7.3 yn fwy amddiffynnol mewn llygod na giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Dangosir canlyniadau staenio AU yn ffig.5d–dd.Roedd gan lygod a chwistrellwyd â giardine alffa-2 ac alffa-7.3 giardine lai o friwiau meinwe duodenal, a amlygwyd gan ddifrod villus, o'i gymharu â llygod a chwistrellwyd â G. duodenalis a llygod a chwistrellwyd â G. duodenalis mewn cyfuniad â fector pcDNA3 gwag .1 Chwyddo.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 neu P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 neu P = 0.0055) ac atroffi crypt wedi'i leihau (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 neu P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 neu P = 0.0191).Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod alffa-2 giardine ac alffa-7,3 giardine yn lleihau heintiad G. duodenalis trwy actifadu'r NLRP3 inflammasome in vivo.
Rôl pcDNA3.1(+)-giardins yn haint G. duodenalis.Cafodd llygod eu himiwneiddio (IM) gyda phlasidau mynegiant ewcaryotig ailgyfunol pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine neu pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ac yna'n cael eu herio gyda codennau G. duodenalis (ig).Defnyddiwyd y grŵp PBS a'r grŵp trin codennau dwodenol pcDNA3.1 (+) fel grwpiau rheoli negyddol, a defnyddiwyd y grŵp trin codennau dwodenol fel grŵp rheoli cadarnhaol.Grŵp arbrofol a threfn driniaeth.b Cafodd MT llygod ym mhob un o'r grwpiau triniaeth amrywiol ei fonitro am 7 diwrnod ar ôl yr her.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol rhwng grwpiau yn y grŵp G. duodenalis a'r grŵp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P < 0.05, **P < 0.01, a ***P < 0.001;mae arwydd y ddoler ($) yn nodi gwahaniaeth sylweddol rhwng pob grŵp o G. duodenalis a'r grŵp jardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3, $$P<0.01 a $$$P<0.001.c Pennwyd llwyth parasitig trwy gyfrif nifer y trofozoites mewn 1 ml o lavage dwodenol o'r dwodenwm (3 cm o hyd) a'i fynegi fel nifer y parasitiaid fesul cm o dwodenwm.Dadansoddwyd y gwahaniaethau rhwng y grŵp haint G. duodenalis, y grŵp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, a'r grŵp giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 gan ANOVA unffordd gan ddefnyddio fersiwn meddalwedd SPSS 22.0.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol yn **P<0.01 a ***P<0.001.d Newidiadau histopatholegol yn y dwodenwm.Mae saethau coch yn dynodi difrod i'r fili, mae saethau gwyrdd yn dynodi difrod i'r crypts.Bar graddfa: 100 µm.e, f Dadansoddiad ystadegol o uchder filws dwodenol llygoden (e) ac uchder crypt (f).Dadansoddwyd y gwahaniaethau rhwng grwpiau yn Ffigur 1d gan ANOVA unffordd gan ddefnyddio meddalwedd SPSS fersiwn 22.0.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol yn *P<0.05 a **P<0.01.Canlyniadau saith arbrawf biolegol annibynnol.ns, ddim yn arwyddocaol (P > 0.05)
Mae Giardia duodenum yn barasit coluddol adnabyddus o bobl a mamaliaid eraill sy'n achosi giardiasis.Yn 2004, fe'i cynhwyswyd ym Menter Clefydau a Esgeuluswyd gan WHO oherwydd ei gyffredinrwydd uchel dros 6 blynedd, yn enwedig mewn cymunedau o statws economaidd-gymdeithasol isel [32].Mae'r system imiwnedd gynhenid ​​yn chwarae rhan hanfodol yn yr ymateb imiwn i haint G. duodenalis.Adroddwyd bod macroffagau llygoden yn amlyncu a lladd G. duodenalis trwy ryddhau trapiau allgellog [33].Mae ein hastudiaethau blaenorol wedi dangos bod G. duodenalis, parasit allgellog anfewnwthiol, yn actifadu llwybrau signalau llidiol p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, a NLRP3 mewn macroffagau llygoden i reoleiddio ymatebion llidiol y gwesteiwr, a gall rhyddhau GEV wella'r broses hon.13], 24].Fodd bynnag, mae'r union PAMPs sy'n ymwneud â NLRP3 llid a reoleiddir gan inflammasome mewn GEV a rôl inflammasome NLRP3 mewn giardiasis yn parhau i gael eu hegluro.I daflu goleuni ar y ddau gwestiwn hyn, cynhaliom yr astudiaeth hon.
Mae'r inflammasome NLRP3 wedi'i leoli yn cytoplasm celloedd imiwnedd a gellir ei actifadu gan wahanol ronynnau fel crisialau asid wrig, tocsinau, bacteria, firysau a pharasitiaid.Mewn astudiaethau bacteriol, mae tocsinau wedi'u nodi fel PAMPs allweddol sy'n actifadu synwyryddion llidiol, gan arwain at lid a marwolaeth celloedd [34].Mae rhai tocsinau strwythurol amrywiol, megis hemolysin o Staphylococcus aureus [35] ac Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) o enterotoxin (NHE) [37], yn achosi actifadu llid NLRP3.Mae astudiaethau firaol wedi dangos bod proteinau ffyrnigrwydd fel protein amlen SARS-COV-2 (E) [38] a phrotein firws Zika NS5 [39] yn PAMPs pwysig a gydnabyddir gan y derbynnydd NLRP3.Mewn astudiaethau parasitiaid, adroddwyd bod llawer o barasitiaid yn gysylltiedig ag actifadu inflammasome lletyol, megis Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], a Leishmania [42].Mae angen y proteinau gronynnog trwchus GRA35, GRA42, a GRA43, sy'n gysylltiedig â ffyrnigrwydd Toxoplasma gondii, ar gyfer sefydlu pyroptosis mewn macrophages llygod mawr Lewis [43].Yn ogystal, mae rhai astudiaethau Leishmania wedi canolbwyntio ar foleciwlau unigol sy'n ymwneud â'r inflammasome NLRP3, megis bilen parasit lipophosphoglycan [44] neu sinc metalloprotease [45].Ymhlith y teulu genynnau alffa-giardin tebyg i anecsin, dangoswyd bod giardin alffa-1 yn ymgeisydd brechlyn posibl sy'n darparu amddiffyniad yn erbyn G. duodenalis mewn model llygoden [18].Yn ein hastudiaeth, dewiswyd G. duodenalis ffactorau ffyrnigrwydd alffa-2 ac alffa-7,3 giardines, sy'n unigryw i giardia ond yn gymharol llai adroddwyd.Cafodd y ddau enyn targed hyn eu clonio i fector system mynegiant ewcaryotig pcDNA3.1 (+) ar gyfer dadansoddi actifadu llid.
Yn ein model llygoden, mae darnau caspase hollt yn farcwyr actifadu llidiol.Ar ôl ei ysgogi, mae NLRP3 yn rhyngweithio ag ASC, yn recriwtio procaspases, ac yn cynhyrchu caspasau gweithredol sy'n hollti pro-IL-1β a pro-IL-18 i IL-1β aeddfed ac IL-18, yn y drefn honno -18.Mae caspasau llidiol (caspases-1, -4, -5 a -11) yn deulu gwarchodedig o broteasau cystein sy'n hanfodol ar gyfer amddiffyniad cynhenid ​​​​ac sy'n ymwneud â llid a marwolaeth celloedd wedi'i raglennu [46].Mae Caspase-1 yn cael ei actifadu gan inflammasomes canonaidd [47], tra bod caspases-4, -5, a -11 yn cael eu hollti wrth ffurfio inflammasomes annodweddiadol [48].Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddefnyddio macroffagau peritoneol llygoden fel model ac ymchwilio i p20 caspase-1 hollt caspase-1 fel marciwr gweithrediad llid NLRP3 gwesteiwr mewn astudiaethau o haint G. duodenalis.Dangosodd y canlyniadau fod llawer o alffa-giardins yn gyfrifol am actifadu llid yn nodweddiadol, sy'n gyson â darganfod moleciwlau ffyrnigrwydd allweddol sy'n ymwneud â bacteria a firysau.Fodd bynnag, dim ond sgrin ragarweiniol yw ein hastudiaeth ac mae moleciwlau eraill sy'n gallu actifadu inflammasomes nad ydynt yn glasurol, fel y canfu ein hastudiaeth flaenorol inflammasomes clasurol ac an-glasurol yn haint G. duodenalis [13].Er mwyn penderfynu ymhellach a yw'r p20 caspase-1 a gynhyrchir yn gysylltiedig â'r inflammasome NLRP3, fe wnaethom drawsnewid giardinau alffa-2 ac alffa-7.3 i mewn i macroffagau peritoneol llygoden i bennu lefelau mynegiant protein moleciwl allweddol a lefelau oligomerization ASC, gan gadarnhau bod y ddau α-giardin yn actifadu llidus NLRP3.Mae ein canlyniadau ychydig yn wahanol i rai Manko-Prykhoda et al., a adroddodd y gall ysgogi celloedd Caco-2 â straenau G. muris neu E. coli EPEC yn unig gynyddu dwyster fflworoleuedd NLRP3, ASC, a caspase-1, er nad yn sylweddol, tra bod sut y cynyddodd costimeiddio G. muris ac E. coli lefelau tri phrotein [49].Gall yr anghysondeb hwn fod oherwydd gwahaniaethau yn y dewis o rywogaethau Giardia, llinellau celloedd, a chelloedd cynradd.Fe wnaethom hefyd berfformio profion in vivo gan ddefnyddio MCC950 mewn llygod WT C57BL/6 benywaidd 5 wythnos oed, sy'n fwy agored i G. duodenalis.Mae MCC950 yn atalydd NLRP3 moleciwl bach grymus a dethol sy'n rhwystro actifadu NLRP3 canonaidd ac an-ganonaidd mewn crynodiadau nanomolar.Mae MCC950 yn atal actifadu NLRP3 ond nid yw'n effeithio ar actifadu llwybrau llidiol AIM2, NLRC4, a NLRP1 na llwybrau signalau TLR [27].Mae MCC950 yn blocio actifadu NLRP3 ond nid yw'n atal cychwyniad NLRP3, efflux K+, mewnlifiad Ca2+, na'r rhyngweithio rhwng NLRP3 ac ASC;yn lle hynny, mae'n atal activation inflammasome NLRP3 trwy rwystro oligomerization ASC [27].Felly, defnyddiwyd MCC950 mewn astudiaeth in vivo i bennu rôl llidus NLRP3 ar ôl pigiad giardine.Mae caspase-1 p10 wedi'i actifadu yn hollti cytocinau pro-llidiol pro-IL-1β a pro-IL-18 i IL-1β aeddfed ac IL-18 [50].Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd lefelau serwm IL-1β mewn llygod wedi'u trin â giardine gyda neu heb MCC950 fel dangosydd a oedd yr inflammasome NLRP3 wedi'i actifadu.Yn ôl y disgwyl, gostyngodd triniaeth MCC950 lefelau serwm IL-1β yn sylweddol.Mae'r data hyn yn dangos yn glir bod G. duodenalis giardin alfa-2 a giardin alfa-7.3 yn gallu actifadu'r llygoden NLRP3 inflammasome.
Mae data sylweddol a gronnwyd dros y degawd diwethaf wedi dangos mai IL-17A yw'r prif reoleiddiwr imiwnedd yn erbyn G. muris, gan ysgogi signalau IL-17RA, cynhyrchu peptidau gwrthficrobaidd, a rheoleiddio actifadu cyflenwad [51].Fodd bynnag, mae haint Giardia yn digwydd yn amlach mewn oedolion ifanc, ac adroddwyd nad yw haint Giardia mewn llygod ifanc yn actifadu'r ymateb IL-17A i gael ei effaith amddiffynnol [52], gan annog ymchwilwyr i chwilio am Giardia imiwnofodwlaidd arall.mecanweithiau haint helminth.Adroddodd awduron astudiaeth ddiweddar y gall G. muris actifadu'r NLRP3 inflammasome gan E. coli EPEC, sy'n hyrwyddo cynhyrchu peptidau gwrthficrobaidd ac yn lleihau ei allu ymlyniad a nifer y trozooites yn y llwybr berfeddol, a thrwy hynny leihau difrifoldeb y colon afiechydon a achosir gan bacilli [49 ].Mae'r inflammasome NLRP3 yn ymwneud â datblygu clefydau amrywiol.Mae astudiaethau wedi dangos bod Pseudomonas aeruginosa yn sbarduno autophagy mewn macroffagau i osgoi marwolaeth celloedd, ac mae'r broses hon yn dibynnu ar actifadu'r NLRP3 inflammasome [53].Ar gyfer N. caninum, mae actifadu'r inflammasome NLRP3 wedi'i gyfryngu gan ocsigen adweithiol yn cyfyngu ar ei ddyblygu yn y gwesteiwr, gan ei wneud yn darged therapiwtig posibl [9].Canfuwyd bod paracoccidioides brasiliensis yn cymell actifadu'r inflammasome NLRP3 mewn celloedd dendritig sy'n deillio o fêr esgyrn llygoden, gan arwain at ryddhau'r cytocin llidiol IL-1β, sy'n chwarae rhan hanfodol mewn amddiffyniad gwesteiwr [10].Mae nifer o rywogaethau Leishmania, gan gynnwys L. amazonensis, L. mawr, L. braziliensis, a L. infantum chagasi, yn actifadu NLRP3 a caspase-1 sy'n ddibynnol ar ASC mewn macrophages, yn ogystal â haint Leishmania.Mae atgynhyrchu parasitiaid yn cael ei wella mewn llygod sy'n ddiffygiol yn y genyn NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Mae Zamboni et al.Dywedwyd bod haint Leishmania yn ysgogi actifadu'r llid NLRP3 mewn macroffagau, sy'n cyfyngu ar ddyblygu parasitiaid mewngellol.Felly, gall Leishmania atal actifadu NLRP3 fel strategaeth osgoi.Mewn astudiaethau in vivo, cyfrannodd y inflammasome NLRP3 at ddileu Leishmania, ond nid oedd yn effeithio ar feinweoedd [54].I'r gwrthwyneb, mewn astudiaethau helminthiasis, roedd actifadu'r inflammasome NLRP3 yn atal imiwnedd amddiffynnol y gwesteiwr yn erbyn helminthiasis gastroberfeddol [12].Shigella yw un o'r prif facteria sy'n achosi dolur rhydd ledled y byd.Gall y bacteria hyn gymell cynhyrchu IL-1β trwy efflux K+ wedi'i gyfryngu gan dderbynnydd P2X7, rhywogaethau ocsigen adweithiol, asideiddio lysosomaidd, a difrod mitocondriaidd.Mae'r inflammasome NLRP3 yn rheoleiddio ffagocytosis a gweithgaredd bactericidal macroffagau yn erbyn Shigella [55].Mae astudiaethau Plasmodium wedi dangos bod llygod diffygiol AIM2, NLRP3 neu caspase-1 sydd wedi'u heintio â Plasmodium yn cynhyrchu lefelau uchel o interfferon math 1 ac yn fwy ymwrthol i haint Plasmodium [56].Fodd bynnag, mae rôl giardine alffa-2 ac alffa-7.3 giardine o ran ysgogi actifadu pathogenig o lid NLRP3 mewn llygod yn aneglur.
Yn yr astudiaeth hon, gostyngodd ataliad o'r inflammasome NLRP3 gan MCC950 BW a chynyddodd nifer y trozooites mewn hylif lavage berfeddol mewn llygod, gan arwain at newidiadau patholegol mwy difrifol mewn meinwe dwodenol.Mae giardine Alpha-2 ac alffa-7.3 giardine yn actifadu'r llygoden gwesteiwr NLRP3 inflammasome, cynyddu pwysau corff y llygoden, lleihau nifer y trozooites mewn hylif lavage berfeddol, a lleddfu briwiau dwodenol patholegol.Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall G. duodenalis actifadu'r llu NLRP3 inflammasome trwy alffa-2 giardine a alpha-7,3 giardine, gan leihau pathogenedd G. duodenalis mewn llygod.
Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n dangos bod giardîns alffa-2 ac alffa-7.3 yn cymell actifadu'r llu NLRP3 yn llidus ac yn lleihau heintiad G. duodenalis mewn llygod.Felly, mae'r moleciwlau hyn yn dargedau addawol ar gyfer atal giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: trosolwg.Datgelwyd yn ddiweddar fod gan Pat Inflamm alergedd i gyffuriau.2019; 13: 134-43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: adolygiad o ffarmacotherapi.Barn Arbenigol fferyllydd.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, ymwrthedd i gyffuriau a darganfod targedau newydd.Mae'n heintio targedau cyffuriau Anhwylder.2010; 10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, ac ati NLRP3 clefydau inflammasome a llidiol.Cell Med Ocsid Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Rôl yr inflammasome mewn llid berfeddol a chanser.Gastroenteroleg.2011;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical ac annodweddiadol actifadu inflammasome NLRP3 ar groesffordd goddefgarwch imiwnedd a llid y perfedd.rhag-imiwn.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Mae actifadu llidus NLRP3 wedi'i gyfryngu gan ROS yn gysylltiedig ag ymateb i haint N. caninum.Parasit fector.2020; 13:449.