Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn gwneud y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae Toxoplasma gondii yn barasit protosoaidd mewngellol sy'n modiwleiddio micro-amgylchedd y gwesteiwr heintiedig ac y gwyddys ei fod yn gysylltiedig â nifer yr achosion o dyfiant tiwmor yr ymennydd.Yn yr astudiaeth hon, rydym yn damcaniaethu bod miRNA-21 ecsosomaidd o haint Tocsoplasma yn hybu twf tiwmor yr ymennydd.Nodweddwyd ecsosomau o ficroglia BV2 a heintiwyd gan Tocsoplasma a chadarnhawyd mewnoliad celloedd glioma U87.Dadansoddwyd proffiliau mynegiant microRNA exosomal gan ddefnyddio araeau o microRNA a microRNA-21A-5p sy'n gysylltiedig â Toxoplasma gondii a didoli tiwmoriaid.Fe wnaethom hefyd ymchwilio i lefelau mRNA o enynnau sy'n gysylltiedig â thiwmor mewn celloedd glioma U87 trwy newid lefelau miR-21 mewn ecsosomau ac effaith ecsosomau ar amlhau celloedd glioma U87 dynol.Mewn exosomes o gelloedd glioma U87 sydd wedi'u heintio â Toxoplasma gondii, cynyddir mynegiant microRNA-21 ac mae gweithgaredd genynnau antitumor (FoxO1, PTEN, a PDCD4) yn cael ei leihau.Mae ecsosomau sy'n deillio o BV2 sydd wedi'u heintio â Tocsoplasma yn achosi amlhau celloedd glioma U87.Mae ecsosomau yn ysgogi twf celloedd U87 mewn model tiwmor llygoden.Rydym yn awgrymu y gallai cynnydd mewn miR-21 ecsosomaidd mewn microglia BV2 sydd wedi'i heintio â Tocsoplasma chwarae rhan bwysig fel hyrwyddwr twf celloedd mewn celloedd glioma U87 trwy ddadreoleiddio genynnau gwrth-tiwmor.
Amcangyfrifir bod mwy na 18.1 miliwn o achosion o ganser datblygedig wedi’u diagnosio ledled y byd yn 2018, gyda thua 297,000 o diwmorau’r system nerfol ganolog yn cael diagnosis bob blwyddyn (1.6% o’r holl diwmorau)1.Mae ymchwil flaenorol wedi dangos bod ffactorau risg ar gyfer datblygu tiwmorau ymennydd dynol yn cynnwys cynhyrchion cemegol amrywiol, hanes teuluol, ac ymbelydredd ïoneiddio o offer therapiwtig a diagnostig y pen.Fodd bynnag, nid yw union achos y malaeneddau hyn yn hysbys.Mae tua 20% o'r holl ganserau ledled y byd yn cael eu hachosi gan gyfryngau heintus, gan gynnwys firysau, bacteria a pharasitiaid3,4.Mae pathogenau heintus yn amharu ar fecanweithiau genetig y gell letyol, megis atgyweirio DNA a chylchred y gell, a gallant arwain at lid cronig a niwed i'r system imiwnedd5.
Asiantau heintus sy'n gysylltiedig â chanser dynol yw'r pathogenau firaol mwyaf cyffredin, gan gynnwys firysau papiloma dynol a firysau hepatitis B a C.Gall parasitiaid hefyd chwarae rhan bosibl yn natblygiad canser dynol.Mae sawl rhywogaeth parasit, sef Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis a Hymenolepis nana, wedi'u cysylltu â gwahanol fathau o ganser dynol 6,7,8.
Mae tocsoplasma gondii yn brotosoan mewngellol sy'n rheoleiddio micro-amgylchedd celloedd lletyol heintiedig.Amcangyfrifir bod y parasit hwn yn heintio tua 30% o boblogaeth y byd, gan roi'r boblogaeth gyfan mewn perygl9,10.Gall tocsoplasma gondii heintio organau hanfodol, gan gynnwys y system nerfol ganolog (CNS), ac achosi salwch difrifol fel llid yr ymennydd angheuol ac enseffalitis, yn enwedig mewn cleifion â imiwnedd gwan9.Fodd bynnag, gall Toxoplasma gondii hefyd newid amgylchedd y gwesteiwr heintiedig trwy fodiwleiddio twf celloedd ac ymatebion imiwn mewn unigolion imiwnogymwys, gan arwain at gynnal haint cronig asymptomatig9,11.Yn ddiddorol, o ystyried y gydberthynas rhwng mynychder T. gondii a mynychder tiwmor yr ymennydd, mae rhai adroddiadau'n awgrymu bod newidiadau amgylcheddol lletyol in vivo oherwydd haint T. gondii cronig yn debyg i ficro-amgylchedd tiwmor.
Gelwir ecsosomau yn gyfathrebwyr rhynggellog sy'n darparu cynnwys biolegol, gan gynnwys proteinau ac asidau niwclëig, o gelloedd cyfagos16,17.Gall ecsosomau ddylanwadu ar brosesau biolegol sy'n gysylltiedig â thiwmor fel gwrth-apoptosis, angiogenesis, a metastasis ym micro-amgylchedd y tiwmor.Yn benodol, mae miRNAs (miRNAs), RNAs bach nad ydynt yn codio tua 22 niwcleotidau o hyd, yn rheolyddion genynnau ôl-drawsysgrifio pwysig sy'n rheoli mwy na 30% o mRNA dynol trwy'r cyfadeilad tawelu a achosir gan miRNA (miRISC).Gall tocsoplasma gondii amharu ar brosesau biolegol trwy reoli mynegiant miRNA mewn gwesteiwyr heintiedig.Mae miRNAs gwesteiwr yn cynnwys arwyddion pwysig ar gyfer rheoleiddio prosesau biolegol lletyol i gyflawni strategaeth goroesi'r parasit.Felly, gall astudio newidiadau ym mhroffil miRNA y gwesteiwr ar haint â T. gondii ein helpu i ddeall y rhyngweithio rhwng y gwesteiwr a T. gondii yn gliriach.Yn wir, mae Thirugnanam et al.Awgrymodd 15 fod T. gondii yn hyrwyddo carcinogenesis yr ymennydd trwy newid ei fynegiant ar miRNAs gwesteiwr penodol sy'n gysylltiedig â thwf tiwmor a chanfuwyd y gall T. gondii achosi gliomas mewn anifeiliaid arbrofol.
Mae'r astudiaeth hon yn canolbwyntio ar newid miR-21 ecsosomaidd mewn microglia gwesteiwr sydd wedi'i heintio â Tocsoplasma BV2.Gwelsom rôl bosibl o newid miR-21 ecsosomaidd yn nhwf celloedd glioma U87 oherwydd bod cnewyllyn FoxO1/p27 yn cael ei gadw yn y cnewyllyn, sef y targed o orfynegiant miR-21.
Cafwyd exosomau sy'n deillio o BV2 gan ddefnyddio centrifugio gwahaniaethol a'u dilysu trwy amrywiol ddulliau i atal halogiad â chydrannau cellog neu fesiglau eraill.Dangosodd electrofforesis gel SDS-polyacrylamid (SDS-PAGE) batrymau gwahanol rhwng proteinau a dynnwyd o gelloedd BV2 ac exosomes (Ffigur 1A), ac aseswyd samplau ar gyfer presenoldeb Alix, a ddadansoddwyd gan blotio Gorllewinol o farcwyr protein ecsosomaidd yn .Darganfuwyd labelu Alix mewn proteinau exosome ond nid mewn proteinau lysate cell BV2 (Ffig. 1 B).Yn ogystal, dadansoddwyd RNA wedi'i buro o exosomau sy'n deillio o BV2 gan ddefnyddio biodadansoddwr.Anaml y gwelwyd is-unedau ribosomaidd 18S a 28S yn y patrwm mudo RNA ecsosomaidd, gan ddangos purdeb dibynadwy (Ffigur 1C).Yn olaf, trosglwyddo microsgopeg electron yn dangos bod y exosomes a arsylwyd oedd tua 60-150 nm o ran maint ac roedd cwpan tebyg i strwythur nodweddiadol o ecsosom morffoleg ( Ffig. 1 D ).
Nodweddu ecsosomau sy'n deillio o gelloedd BV2.(A) Tudalen taflen ddata diogelwch.Roedd proteinau'n cael eu hynysu o gelloedd BV2 neu ecsosomau yn deillio o BV2.Mae patrymau protein yn amrywio rhwng celloedd ac ecsosomau.(B) Dadansoddiad blot gorllewinol o farciwr ecsosomaidd (Alix).(C) Gwerthusiad o RNA wedi'i buro o gelloedd BV2 ac ecsosomau deillio BV2 gan ddefnyddio biodadansoddwr.Felly, anaml y canfuwyd is-unedau ribosomaidd 18S a 28S mewn celloedd BV2 mewn RNA ecsosomaidd.(D) Dangosodd microsgopeg electron trosglwyddo fod ecsosomau wedi'u hynysu o gelloedd BV2 wedi'u staenio'n negyddol â 2% o asetad wranyl.Mae ecsosomau tua 60-150 nm o ran maint a siâp cwpan (Song and Jung, data heb ei gyhoeddi).
Gwelwyd mewnoliad cellog o ecsosomau sy'n deillio o BV2 i gelloedd glioma dynol U87 gan ddefnyddio microsgopeg confocal.Mae ecsosomau â label PKH26 wedi'u lleoli yn cytoplasm celloedd U87.Cafodd niwclei eu staenio â DAPI (Ffig. 2A), sy'n nodi y gall celloedd lletyol fewnoli exosomau sy'n deillio o BV2 a dylanwadu ar amgylchedd celloedd derbynnydd.
Fe wnaeth mewnoli exosomau sy'n deillio o BV2 i gelloedd glioma U87 ac ecsosomau sy'n deillio o BV2 sydd wedi'u heintio â Tocsoplasma RH amlhau celloedd glioma U87.(A) Ecsosomau wedi'u llyncu gan gelloedd U87 wedi'u mesur gan ficrosgopeg confocal.Deorwyd celloedd glioma U87 ag ecsosomau wedi'u labelu â PKH26 (coch) neu heb reolaeth am 24 awr.Cafodd y niwclysau eu staenio â DAPI (glas) ac yna arsylwyd arnynt o dan ficrosgop confocal (bar graddfa: 10 μm, x 3000).(B) Penderfynwyd ar amlhau celloedd glioma U87 gan assay amlhau celloedd.Cafodd celloedd glioma U87 eu trin ag ecsosomau am yr amser a nodwyd. *Cafwyd P <0.05 trwy brawf t Myfyriwr. *Cafwyd P <0.05 trwy brawf t Myfyriwr. *P < 0,05 y cant ar gyfer y rhestr fer. *P < 0.05 erbyn prawf-t Myfyriwr. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 a gafwyd gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr.
Ar ôl cadarnhau mewnoli exosomau sy'n deillio o BV2 i gelloedd glioma U87, gwnaethom gynnal profion amlhau celloedd i ymchwilio i rôl ecsosomau sy'n deillio o Tocsoplasma sy'n deillio o BV2 yn natblygiad celloedd glioma dynol.Dangosodd triniaeth o gelloedd U87 ag ecsosomau o gelloedd BV2 a heintiwyd gan T. gondii fod ecsosomau sy'n deillio o BV2 wedi'u heintio â T. gondii wedi achosi amlder sylweddol uwch o gelloedd U87 o gymharu â rheolaeth (Ffig. 2 B).
Yn ogystal, cafodd twf celloedd U118 yr un canlyniadau ag U87, gan fod ecsosomau a ysgogwyd gan Tocsoplasma wedi achosi'r lefelau uchaf o amlhau (data heb ei ddangos).Yn seiliedig ar y data hyn, gallwn nodi bod ecsosomau sydd wedi'u heintio â Tocsoplasma sy'n deillio o BV2 yn chwarae rhan bwysig mewn amlhau celloedd glioma.
Er mwyn ymchwilio i effaith ecsosomau sy'n deillio o BV2 wedi'u heintio â Tocsoplasma ar ddatblygiad tiwmor, gwnaethom chwistrellu celloedd glioma U87 i lygod noethlymun ar gyfer model senograft a chwistrellu ecsosomau sy'n deillio o BV2 neu ecsosomau sy'n deillio o BV2 wedi'u heintio â RH.Ar ôl i diwmorau ddod yn amlwg ar ôl 1 wythnos, rhannwyd pob grŵp arbrofol o 5 llygod yn ôl maint tiwmor i bennu'r un man cychwyn, a mesurwyd maint tiwmor am 22 diwrnod.
Mewn llygod gyda'r model xenograft U87, gwelwyd maint a phwysau tiwmor llawer mwy yn y grŵp exosome heintiedig RH sy'n deillio o BV2 ar ddiwrnod 22 (Ffig. 3 A, B).Ar y llaw arall, nid oedd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol mewn maint tiwmor rhwng y grŵp exosome sy'n deillio o BV2 a'r grŵp rheoli ar ôl triniaeth ecsosomaidd.Yn ogystal, llygod wedi'u chwistrellu â chelloedd glioma ac ecsosomau oedd yn dangos y cyfaint tiwmor mwyaf yn weledol yn y grŵp o ecsosomau sy'n deillio o BV2 wedi'u heintio â RH (Ffig. 3 C).Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod ecsosomau sydd wedi'u heintio â Tocsoplasma sy'n deillio o BV2 yn ysgogi twf glioma mewn model tiwmor llygoden.
Oncogenesis (AC) o ecsosomau sy'n deillio o BV2 mewn model llygoden xenograft U87.Cynyddwyd maint tiwmor (A) a phwysau (B) yn sylweddol mewn llygod noethlymun BALB/c a gafodd eu trin ag ecsosomau heintiedig RH sy'n deillio o BV2.Cafodd llygod noethlymun BALB/c (C) eu chwistrellu'n isgroenol gyda chelloedd 1 x 107 U87 wedi'u hatal mewn cymysgedd Matrigel.Chwe diwrnod ar ôl y pigiad, cafodd 100 μg o exosomau sy'n deillio o BV2 eu trin mewn llygod.Mesurwyd maint a phwysau tiwmor ar y dyddiau a nodwyd ac ar ôl aberth, yn y drefn honno. *P < 0.05. *P < 0.05. *Р < 0,05. *P < 0.05. *P < 0.05. *P < 0.05. *Р < 0,05. *P < 0.05.
Mae'r data yn dangos bod 37 miRNAs (16 overexpressed a 21 downexpressed) sy'n gysylltiedig ag imiwnedd neu ddatblygiad tiwmor eu newid yn sylweddol yn microglia ar ôl haint gyda'r straen Toxoplasma RH (Ffig. 4 A).Cadarnhawyd lefelau mynegiant cymharol miR-21 ymhlith miRNAs wedi'u newid gan RT-PCR amser real mewn exosomau sy'n deillio o BV2, ecsosomau a gafodd eu trin â chelloedd BV2 ac U87.Dangosodd mynegiant miR-21 gynnydd sylweddol mewn ecsosomau o gelloedd BV2 sydd wedi'u heintio â Toxoplasma gondii (straen RH) (Ffig. 4 B).Cynyddodd lefelau mynegiant cymharol miR-21 mewn celloedd BV2 a U87 ar ôl i nifer yr ecsosomau newydd gael eu derbyn (Ffig. 4 B).Roedd lefelau cymharol mynegiant miR-21 ym meinweoedd ymennydd cleifion tiwmor a llygod sydd wedi'u heintio â Toxoplasma gondii (straen ME49) yn uwch nag mewn rheolaethau, yn y drefn honno (Ffig. 4 C).Mae'r canlyniadau hyn yn cydberthyn â gwahaniaethau rhwng lefelau mynegiant y microRNAs a ragfynegwyd ac a gadarnhawyd mewn vitro ac in vivo.
Newidiadau yn y mynegiant o ecsosomaidd miP-21a-5p mewn microglia sydd wedi'i heintio â Toxoplasma gondii (RH).(A) Yn dangos newidiadau sylweddol mewn siRNA sy'n gysylltiedig ag imiwnedd neu ddatblygiad tiwmor yn dilyn haint T. gondii RH.(B) Canfuwyd lefelau mynegiant cymharol miR-21 gan RT-PCR amser real mewn exosomau sy'n deillio o BV2, exosomau wedi'u trin â BV2, a chelloedd U87.(C) Darganfuwyd lefelau mynegiant cymharol miR-21 ym meinweoedd ymennydd cleifion tiwmor (N = 3) a llygod wedi'u heintio â Toxoplasma gondii (straen ME49) (N = 3). *Cafwyd P <0.05 trwy brawf t Myfyriwr. *Cafwyd P <0.05 trwy brawf t Myfyriwr. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *Cafwyd P <0.05 gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 a gafwyd gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr.
Arweiniodd ecsosomau o gelloedd BV2 a heintiwyd gan RH at dwf gliomas in vivo ac in vitro (Ffig. 2, 3).Er mwyn canfod mRNAs perthnasol, archwiliwyd lefelau mRNA o enynnau targed antitumor, blwch pen fforch O1 (FoxO1), PTEN, a marwolaeth celloedd 4 wedi'i raglennu (PDCD4) mewn celloedd U87 sydd wedi'u heintio ag ecsosomau sy'n deillio o BV2 neu RH BV2.Mae dadansoddiad biowybodeg wedi dangos bod gan nifer o enynnau sy'n gysylltiedig â thiwmor, gan gynnwys y genynnau FoxO1, PTEN, a PDCD4, safleoedd rhwymo miR-2121,22.Gostyngwyd lefelau mRNA o enynnau targed antitumor mewn exosomau sy'n deillio o BV2 wedi'u heintio â RH o'u cymharu ag ecsosomau sy'n deillio o BV2 (Ffig. 5A).Dangosodd FoxO1 lefelau protein is mewn ecsosomau sy'n deillio o BV2 wedi'u heintio â RH o gymharu ag exosomau sy'n deillio o BV2 (Ffigur 5B).Yn seiliedig ar y canlyniadau hyn, gallem gadarnhau bod ecsosomau sy'n deillio o BV2 sydd wedi'u heintio â RH yn is-reoleiddio genynnau gwrth-oncogenig, gan gynnal eu rôl mewn twf tiwmor.
Tocsoplasma ecsosomau sy'n deillio o BV2 sydd wedi'u heintio â RH sy'n peri i ecsosomau sy'n deillio o BV2 sydd wedi'u heintio â RH sy'n atal genynnau gwrth-tiwmor mewn celloedd glioma U87.(A) PCR amser real o fynegiant FoxO1, PTEN a PDCD4 mewn ecsosomau sy'n deillio o BV2 heintiedig RH T. gondii o'i gymharu ag ecsosomau PBS.Defnyddiwyd mRNA β-actin fel rheolydd.(B) Pennwyd mynegiant FoxO1 gan blotio'r Gorllewin a gwerthuswyd data densitometreg yn ystadegol gan ddefnyddio rhaglen ImageJ. *Cafwyd P <0.05 trwy brawf t Myfyriwr. *Cafwyd P <0.05 trwy brawf t Myfyriwr. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *Cafwyd P <0.05 gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 a gafwyd gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr.
Er mwyn deall effaith miP-21 mewn ecsosomau ar reoleiddio genynnau sy'n gysylltiedig â thiwmor, cafodd celloedd U87 eu trawsosod ag atalydd o miP-21 gan ddefnyddio Lipofectamine 2000 a chynaeafwyd y celloedd 24 awr ar ôl trawsgludiad.Cymharwyd lefelau mynegiant FoxO1 a p27 mewn celloedd a drawslifwyd ag atalyddion miR-21 â chelloedd a gafodd eu trin ag exosomau sy'n deillio o BV2 gan ddefnyddio qRT-PCR (Ffig. 6A, B).Trawsnewid yr atalydd miR-21 i mewn i gelloedd U87 is-reoleiddio sylweddol FoxO1 a mynegiant t27 (FIG. 6).
Newidiwyd mynegiant FoxO1/p27 ecsosomaidd sy'n deillio o BV2 sy'n deillio o RH-21 mewn celloedd glioma U87.Trawsnewidiwyd celloedd U87 ag atalydd miP-21 gan ddefnyddio Lipofectamine 2000 a chafodd celloedd eu cynaeafu 24 awr ar ôl trawsgludiad.Cymharwyd lefelau mynegiant FoxO1 a p27 mewn celloedd a drawsnewidiwyd ag atalyddion miR-21 â lefelau mewn celloedd a gafodd eu trin ag exosomau sy'n deillio o BV2 gan ddefnyddio qRT-PCR (A, B).
Er mwyn dianc rhag ymateb imiwn y gwesteiwr, mae'r parasit Tocsoplasma yn trawsnewid yn goden meinwe.Maent yn parasiteiddio meinweoedd amrywiol, gan gynnwys yr ymennydd, y galon, a chyhyr ysgerbydol, trwy gydol oes y gwesteiwr ac yn modiwleiddio ymateb imiwn y gwesteiwr.Yn ogystal, gallant reoleiddio cylchred celloedd ac apoptosis celloedd lletyol, gan hyrwyddo eu lluosogiad14,24.Mae tocsoplasma gondii yn heintio celloedd dendritig lletyol, neutrophils, a llinach monocyte/macrophage yn bennaf, gan gynnwys microglia'r ymennydd.Mae tocsoplasma gondii yn cymell gwahaniaethu macroffagau o'r ffenoteip M2, yn effeithio ar wella clwyfau ar ôl haint pathogen, ac mae hefyd yn gysylltiedig â gor-fasgwlaidd a ffibrosis granulomatous.Gall y pathogenesis ymddygiadol hwn o haint Tocsoplasma fod yn gysylltiedig â marcwyr sy'n gysylltiedig â datblygiad tiwmor.Gall yr amgylchedd gelyniaethus a reoleiddir gan Tocsoplasma ymdebygu i'r rhag-ganser cyfatebol.Felly, gellir tybio y dylai haint Tocsoplasma gyfrannu at ddatblygiad tiwmorau'r ymennydd.Mewn gwirionedd, mae cyfraddau uchel o haint Tocsoplasma wedi'u nodi yn serwm cleifion â thiwmorau amrywiol ar yr ymennydd.Yn ogystal, gall Toxoplasma gondii fod yn effeithydd carcinogenig arall a gweithredu'n synergyddol i helpu carcinogenau heintus eraill i ddatblygu tiwmorau ar yr ymennydd.Yn hyn o beth, mae'n werth nodi bod firws P. falciparum a Epstein-Barr yn cyfrannu'n synergyddol at ffurfio lymffoma Burkitt.
Mae rôl ecsosomau fel rheolyddion ym maes ymchwil canser wedi cael ei hymchwilio’n helaeth.Fodd bynnag, nid oes llawer o ddealltwriaeth o hyd ynghylch rôl ecsosomau rhwng parasitiaid a gwesteiwyr heintiedig.Hyd yn hyn, mae rheolyddion amrywiol, gan gynnwys proteinau wedi'u secretu, wedi esbonio'r prosesau biolegol y mae parasitiaid protosoaidd yn eu defnyddio i wrthsefyll ymosodiad gwesteiwr a pharhau â haint.Yn ddiweddar, bu cysyniad cynyddol bod microfesiglau sy'n gysylltiedig â phrotozoa a'u microRNAs yn rhyngweithio â chelloedd cynnal i greu amgylchedd ffafriol ar gyfer eu goroesiad.Felly, mae angen astudiaethau pellach i ddarganfod y berthynas rhwng miRNAs ecsosomaidd wedi'u newid ac amlhau celloedd glioma.Mae newid microRNA (genynnau clwstwr miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 a miR-17-92) yn rhwymo'r hyrwyddwr STAT3 mewn macroffagau dynol sydd wedi'u heintio â tocsoplasma, ac yn achosi gwrth -apoptosis mewn ymateb i haint Tocsoplasma gondii 29 .Mae heintiad tocsoplasma yn cynyddu mynegiant miR-17-5p a miR-106b-5p, sy'n gysylltiedig â nifer o glefydau hyperproliferative 30 .Mae'r data hyn yn awgrymu bod miRNAs lletyol a reoleiddir gan haint Tocsoplasma yn foleciwlau pwysig ar gyfer goroesiad parasitiaid a phathogenesis mewn ymddygiad biolegol lletyol.
Gall newid miRNAs ddylanwadu ar wahanol fathau o ymddygiad yn ystod cychwyn a dilyniant celloedd malaen, gan gynnwys gliomas: hunangynhaliaeth signalau twf, ansensitifrwydd i signalau sy'n atal twf, osgoi apoptosis, potensial atgynhyrchu diderfyn, angiogenesis, goresgyniad a metastasis, a llid.Mewn glioma, mae miRNAs wedi'u newid wedi'u nodi mewn sawl astudiaeth proffilio mynegiant.
Yn yr astudiaeth bresennol, gwnaethom gadarnhau lefelau uchel o fynegiant miRNA-21 mewn celloedd lletyol heintiedig tocsoplasma.Mae miR-21 wedi'i nodi fel un o'r microRNAs a orfynegir amlaf mewn tiwmorau solet, gan gynnwys gliomas, 33 ac mae ei fynegiant yn cyd-fynd â gradd glioma.Mae tystiolaeth gronnus yn awgrymu bod miR-21 yn oncogene newydd sy'n gweithredu fel ffactor gwrth-apoptotig mewn twf glioma ac sy'n cael ei or-fynegi'n fawr mewn meinweoedd a phlasma malaeneddau ymennydd dynol.Yn ddiddorol, mae anactifadu miR-21 mewn celloedd a meinweoedd glioma yn sbarduno ataliad amlhau celloedd oherwydd apoptosis sy'n ddibynnol ar caspase.Datgelodd dadansoddiad biowybodus o dargedau a ragwelir miR-21 genynnau atal tiwmor lluosog sy'n gysylltiedig â llwybrau apoptosis, gan gynnwys marwolaeth celloedd 4 (PDCD4) wedi'i raglennu, tropomyosin (TPM1), PTEN, a blwch blaen fforch O1 (FoxO1), gyda'r safle rhwymo miR-2121..22.38.
Mae FoxO1, fel un o'r ffactorau trawsgrifio (FoxO), yn ymwneud â datblygu gwahanol fathau o ganser dynol a gall reoleiddio mynegiant genynnau atal tiwmor fel p21, p27, Bim, a FasL40.Gall FoxO1 rwymo ac actifadu atalyddion cylchred celloedd fel p27 i atal twf celloedd.At hynny, mae FoxO1 yn un o effeithiau allweddol signalau PI3K/Akt ac mae'n rheoleiddio llawer o brosesau biolegol megis dilyniant cylchred celloedd a gwahaniaethu celloedd trwy actifadu trawsgrifiad p2742.
I gloi, credwn y gallai miR-21 exosomal sy'n deillio o microglia sydd wedi'i heintio â Tocsoplasma chwarae rhan bwysig fel rheolydd twf celloedd glioma (Ffig. 7).Fodd bynnag, mae angen astudiaethau pellach i ddod o hyd i gysylltiad uniongyrchol rhwng miR-21 ecsosomaidd, haint Tocsoplasma wedi'i newid, a thwf glioma.Disgwylir i'r canlyniadau hyn fod yn fan cychwyn ar gyfer astudio'r berthynas rhwng haint Tocsoplasma a nifer yr achosion o glioma.
Cynigir diagram sgematig o fecanwaith carcinogenesis glioma (ymennydd) yn yr astudiaeth hon.Mae'r awdur yn tynnu llun PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Roedd yr holl brotocolau arbrofol yn yr astudiaeth hon, gan gynnwys defnyddio anifeiliaid, yn unol â Chanllawiau Moesegol Safonol Pwyllgor Gofal Anifeiliaid a Defnyddwyr Prifysgol Genedlaethol Seoul ac fe'u cymeradwywyd gan Fwrdd Adolygu Sefydliadol Ysgol Feddygaeth Prifysgol Genedlaethol Seoul (rhif IRB SNU- 150715).-2).Cynhaliwyd yr holl weithdrefnau arbrofol yn unol ag argymhellion ARRIVE.
Cafodd microglia llygoden BV2 a chelloedd glioma dynol U87 eu meithrin yng Nghanolig Eryr Addasedig Dulbecco (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) a Chanolig Sefydliad Coffa Roswell Park (RPMI; Welgene), yn y drefn honno, pob un yn cynnwys serwm buchol ffetws 10%, 4 mM l- glutamin, penisilin 0.2 mM a streptomycin 0.05 mM.Cafodd celloedd eu meithrin mewn deorydd gyda 5% o CO2 ar 37°C.Defnyddiwyd llinell gell glioma arall, U118, i gymharu â chelloedd U87.
Er mwyn ynysu ecsosomau o rywogaethau RH ac ME49 heintiedig T. gondii, cafodd tachyzoites T. gondii (straen RH) eu cynaeafu o geudod abdomen llygod 6 wythnos oed BALB/c a chwistrellwyd 3-4 diwrnod cyn hynny.Roedd tachyzoites yn cael eu golchi deirgwaith gyda PBS a'u puro trwy allgyrchiad yn 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA)43.I gael tachyzoites o straen ME49, chwistrellwyd llygod BALB/c yn fewnberitoneol gyda 20 o goden meinwe a thrawsnewid tachyzoite mewn codennau ei gasglu trwy olchi ceudod yr abdomen ar y 6-8fed diwrnod ar ôl haint (PI).Llygod sydd wedi'u heintio â PBS.Tyfwyd tachyzoites ME49 mewn celloedd wedi'u hategu â phenisilin 100 μg/ml (Gibco/BRL, Grand Island, NY, UDA), streptomycin 100 μg/ml (Gibco/BRL), a serwm buchol ffetws 5% (Lonza, Walkersville, MD ) .., UDA) ar 37 ° C a 5% carbon deuocsid.Ar ôl tyfu yng nghelloedd Vero, cafodd tachyzoites ME49 eu pasio ddwywaith trwy nodwydd 25 medr ac yna trwy ffilter 5 µm i gael gwared ar falurion a chelloedd.Ar ôl golchi, cafodd y tachyzoites eu hailddarparu yn PBS44.Cafodd codennau meinwe o straen Toxoplasma gondii ME49 eu cynnal trwy chwistrelliad mewnperitoneol o godennau wedi'u hynysu o ymennydd llygod heintiedig C57BL/6 (Canolfan Bio Anifeiliaid Orient, Seongnam, Korea).Cynaeafwyd ymennydd llygod heintiedig ME49 ar ôl 3 mis o PI a'u briwio o dan ficrosgop i ynysu codennau.Cadwyd y llygod heintiedig o dan amodau arbennig heb bathogen (SPF) yn Ysgol Feddygaeth Prifysgol Genedlaethol Seoul.
Echdynnwyd cyfanswm RNA o exosomau sy'n deillio o BV2, celloedd BV2 a meinweoedd gan ddefnyddio'r MiRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, yr Almaen) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, gan gynnwys yr amser deori ar gyfer y cam elution.Penderfynwyd ar y crynodiad RNA ar sbectroffotomedr NanoDrop 2000.Aseswyd ansawdd micro-araeau RNA gan ddefnyddio biodadansoddwr Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, yr Iseldiroedd).
Paratowyd DMEM gyda 10% o FBS gwael ecsosomaidd trwy allgyrchiant ar 100,000g am 16 awr ar 4°C a'i hidlo trwy hidlydd 0.22 µm (Nalgene, Rochester, NY, UDA).Cafodd celloedd BV2, 5 × 105, eu meithrin mewn DMEM sy'n cynnwys 10% o FBS wedi'i ddihysbyddu exosome ac 1% o wrthfiotigau ar 37 ° C a 5% CO2.Ar ôl 24 awr o ddeori, ychwanegwyd tachyzoites o straen RH neu ME49 (MOI = 10) at y celloedd a chafodd parasitiaid anymledol eu tynnu o fewn awr a'u hail-lenwi â DMEM.Cafodd ecsosomau o gelloedd BV2 eu hynysu gan allgyrchiant gwahaniaethol wedi'i addasu, y dull a ddefnyddir fwyaf.Ailddaliwch y belen ecsosom mewn 300 µl PBS ar gyfer dadansoddiad RNA neu brotein.Penderfynwyd ar y crynodiad o ecsosomau ynysig gan ddefnyddio pecyn profi protein BCA (Pierce, Rockford, IL, UDA) a sbectroffotomedr NanoDrop 2000.
Cafodd gwaddodion o gelloedd BV2 neu ecsosomau yn deillio o BV2 eu rhoi mewn hydoddiant echdynnu protein PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) a llwythwyd proteinau ar geliau polyacrylamid SDS 10% SDS â staen glas gwych.Yn ogystal, trosglwyddwyd proteinau i bilenni PVDF am 2 awr.Dilyswyd blotiau gorllewinol gan ddefnyddio'r gwrthgorff Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, UDA) fel marciwr exosomal.Defnyddiwyd IgG (H + L) gwrth-lygoden gafr cyfunedig HRP (Bethyl Laboratories, Trefaldwyn, TX, UDA) a dadansoddwr delwedd luminescent LAS-1000 a mwy (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) fel gwrthgorff eilaidd..Perfformiwyd microsgopeg electron trosglwyddo i astudio maint a morffoleg exosomau.Paratowyd ecsosomau wedi'u hynysu o gelloedd BV2 (6.40 µg/µl) ar rwyllau wedi'u gorchuddio â charbon a'u staenio'n negyddol â 2% asetad wranyl am 1 munud.Arsylwyd y samplau a baratowyd ar foltedd cyflymu o 80 kV gan ddefnyddio JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japan) gyda chamera CCD ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, UDA).
Cafodd ecsosomau sy'n deillio o BV2 eu staenio gan ddefnyddio Pecyn Cyswllt Fflwroleuol Coch PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA) am 15 munud ar dymheredd ystafell.Cafodd celloedd U87, 2 × 105, gydag ecsosomau (coch) wedi'u labelu â PKH26 neu ddim ecsosomau fel rheolaeth negyddol, eu deor ar 37 ° C am 24 awr mewn deorydd CO2 5%.Cafodd niwclysau celloedd U87 eu staenio â DAPI (glas), gosodwyd celloedd U87 mewn paraformaldehyde 4% am 15 munud ar 4 ° C ac yna eu dadansoddi mewn system microsgop confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, yr Almaen).gweladwy.
Cafodd cDNA ei syntheseiddio o siRNA gan ddefnyddio synthesis llinyn cyntaf SiRNA Mir-X a phecyn qRT-PCR SYBR (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Perfformiwyd PCR meintiol amser real gan ddefnyddio system ganfod PCR amser real iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA) gan ddefnyddio paent preimio a thempledi wedi'u cymysgu â SYBR Premix.Cafodd DNA ei fwyhau am 40 cylch o ddadnatureiddio ar 95°C am 15 s ac anelio ar 60°C am 60 s.Dadansoddwyd y data o bob adwaith PCR gan ddefnyddio modiwl dadansoddi data meddalwedd system optegol iQ™5 (Bio-Rad).Cyfrifwyd newidiadau cymharol mewn mynegiant genynnau rhwng genynnau targed dethol a β-actin/siRNA (ac U6) gan ddefnyddio'r dull cromlin safonol.Dangosir y dilyniannau preimio a ddefnyddiwyd yn Nhabl 1.
Cafodd celloedd glioma 3 x 104 U87 eu hadu mewn platiau 96-ffynnon a'u cymysgu ag ecsosomau heintiedig â Toxoplasma yn deillio o exosomau BV2 (50 μg / mL) neu nonpulse sy'n deillio o BV2 (50 μg / mL) fel rheolaethau ar 12, 18 a 36 awr .Pennwyd y gyfradd amlhau celloedd gan ddefnyddio'r Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (Ffigurau Atodol S1-S3) 46 .
Prynwyd llygod noethlymun benywaidd 5 wythnos oed BALB/c gan Orient Bio (Seongnam-si, De Korea) a'u cadw'n unigol mewn cewyll di-haint ar dymheredd ystafell (22 ± 2 ° C) a lleithder (45 ± 15 ° C).%) ar dymheredd ystafell (22±2°C) a lleithder (45±15%).Perfformiwyd cylch golau 12 awr a chylch tywyll 12 awr o dan SPF (Canolfan Anifeiliaid Ysgol Feddygaeth Prifysgol Genedlaethol Seoul).Rhannwyd llygod ar hap yn dri grŵp o 5 llygod yr un a chwistrellwyd pob grŵp yn isgroenol gyda 400 ml o PBS yn cynnwys celloedd glioma 1 x 107 U87 a ffactor twf wedi'i leihau BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, UDA).Chwe diwrnod ar ôl pigiad tiwmor, chwistrellwyd 200 mg o ecsosomau yn deillio o gelloedd BV2 (gyda/heb haint Tocsoplasma) i mewn i safle'r tiwmor.Dau ddiwrnod ar hugain ar ôl haint tiwmor, mesurwyd maint tiwmor llygod ym mhob grŵp â chaliper dair gwaith yr wythnos, a chyfrifwyd cyfaint y tiwmor gan y fformiwla: 0.5 × (lled) × 2 × hyd.
Dadansoddiad mynegiant MicroRNA gan ddefnyddio arae miRNA miRCURYTM LNA, mae gan y 7fed genhedlaeth, araeau mmu a rno (EXIQON, Vedbaek, Denmarc) yn cwmpasu 1119 o lygod â nodweddion da ymhlith 3100 o stilwyr dal miRNA dynol, llygoden a llygod mawr.Yn ystod y driniaeth hon, tynnwyd 250 i 1000 ng o gyfanswm RNA o'r 5′-ffosffad trwy driniaeth â ffosffatas alcalïaidd berfeddol lloi ac yna labelu â lliw fflwroleuol gwyrdd Hy3.Yna cafodd y samplau wedi'u labelu eu hybrideiddio trwy lwytho sleidiau microarray gan ddefnyddio pecyn siambr hybrideiddio (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, UDA) a phecyn sleidiau hybrideiddio (Agilent Technologies).Cynhaliwyd hybrideiddio am 16 awr ar 56 ° C, yna golchwyd y micro-araeau yn unol ag argymhellion y gwneuthurwr.Yna sganiwyd y sleidiau micro-arae wedi'u prosesu gan ddefnyddio system sganiwr micro-arae Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Mewnforiwyd delweddau wedi'u sganio gan ddefnyddio meddalwedd Agilent Feature Extraction fersiwn 10.7.3.1 (Agilent Technologies) a mesurwyd dwyster fflworoleuedd pob delwedd gan ddefnyddio ffeil GAL cyfatebol y protocol Exiqon wedi'i addasu.Mae data microarray ar gyfer yr astudiaeth gyfredol yn cael eu hadneuo yng nghronfa ddata GEO o dan y rhif derbyn GPL32397.
Dadansoddwyd proffiliau mynegiant miRNAs ecsosomaidd aeddfed mewn microglia o rywogaethau RH neu ME49 sydd wedi'u heintio â Tocsoplasma gan ddefnyddio offer rhwydwaith amrywiol.Nodwyd miRNAs sy'n gysylltiedig â datblygiad tiwmor gan ddefnyddio miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) a'u hidlo allan gyda dwyster signal wedi'i normaleiddio (log2) yn fwy na 8.0.Ymhlith miRNAs, canfuwyd bod miRNAs a fynegwyd yn wahaniaethol yn fwy na 1.5-plyg wedi'u newid gan ddadansoddiad hidlo o miRNAs a newidiwyd gan straenau RH neu ME49 wedi'u heintio â T. gondii.
Cafodd celloedd eu hadu mewn platiau chwe ffynnon (3 x 105 cell/ffynnon) yn opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, UDA) gan ddefnyddio Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, UDA).Cafodd y celloedd a drawslifwyd eu meithrin am 6 awr ac yna newidiwyd y cyfrwng i gyfrwng cyflawn ffres.Cafodd celloedd eu cynaeafu 24 awr ar ôl eu trawsnewid.
Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol yn bennaf gan ddefnyddio meddalwedd prawf-t Myfyrwyr gyda meddalwedd Excel (Microsoft, Washington, DC, UDA).Ar gyfer dadansoddiad anifeiliaid arbrofol, perfformiwyd ANOVA dwy ffordd gan ddefnyddio meddalwedd Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, UDA). Ystyriwyd bod gwerthoedd P < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol. Ystyriwyd bod gwerthoedd P < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Ystyriwyd bod gwerthoedd P <0.05 yn ystadegol arwyddocaol. P 值< 0.05 milltir i ffwrdd. P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Ystyriwyd bod gwerthoedd P <0.05 yn ystadegol arwyddocaol.
Cymeradwywyd yr holl brotocolau arbrofol a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon gan Fwrdd Adolygu Sefydliadol Ysgol Feddygaeth Prifysgol Genedlaethol Seoul (rhif IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Amlder a marwolaethau canser byd-eang amcangyfrifedig yn 2018: Ffynonellau a dulliau GLOBOCAN.Dehongliad.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Cipolwg ar ffactorau risg tiwmorau ar yr ymennydd a'u hymyriadau therapiwtig. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Cipolwg ar ffactorau risg tiwmorau ar yr ymennydd a'u hymyriadau therapiwtig.Rashid, S., Rehman, K. ac Akash, MS Adolygiad o ffactorau risg ar gyfer tiwmorau ar yr ymennydd ac ymyriadau therapiwtig mawr. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Dealltwriaeth ddofn o ffactorau risg tiwmor yr ymennydd ac ymyriadau therapiwtig.Rashid, S., Rehman, K. ac Akash, MS Adolygiad o ffactorau risg ar gyfer tiwmorau ar yr ymennydd ac ymyriadau therapiwtig mawr.Gwyddoniaeth fiofeddygol.Fferyllydd.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Rhyngweithiadau bacteriol-firaol mewn canserau llwybr cenhedlol oresymudol dynol a benywaidd: Crynodeb o dystiolaeth epidemiolegol a labordy. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Rhyngweithiadau bacteriol-firaol mewn canserau llwybr cenhedlol oresymudol dynol a benywaidd: Crynodeb o dystiolaeth epidemiolegol a labordy.Kato I., Zhang J. a Sun J. Rhyngweithiadau bacteriol-firaol mewn canser y llwybr gastroberfeddol dynol a llwybr genital benywaidd: crynodeb o ddata epidemiolegol a labordy. Kato, I., Zhang, J. a Sun, J.总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Rhyngweithiad bacterio-firaol mewn treuliad ceudod llafar dynol a llwybr atgenhedlu benywaidd: crynodeb o wyddoniaeth afiechyd poblogaidd a thystiolaeth labordy.Kato I., Zhang J. a Sun J. Rhyngweithiadau bacteriol-firaol mewn canser gastroberfeddol dynol a chanser gwenerol benywaidd: crynodeb o ddata epidemiolegol a labordy.Canser 14, 425 (2022).
Magon, KL a Plwyf, JL O haint i ganser: Sut mae firysau tiwmor DNA yn newid metaboledd carbon a lipid canolog celloedd lletyol. Magon, KL a Plwyf, JL O haint i ganser: Sut mae firysau tiwmor DNA yn newid metaboledd carbon a lipid canolog celloedd lletyol.Mahon, KL a Plwyf, JL Haint tân i ganser: sut mae firysau tiwmor sy'n seiliedig ar DNA yn newid metaboledd carbon a lipid canolog celloedd lletyol. Magon, KL & Parish, JL Enwi:DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代。 Magon, KL a Plwyf, JL O haint i ganser: sut mae firysau tiwmor DNA yn newid metaboledd carbon a lipid canolog celloedd lletyol.Mahon, KL a Plwyf, JL Yn tanio haint i ganser: sut mae firysau tiwmor DNA yn newid metaboledd carbon a lipid canolog mewn celloedd cynnal.Bioleg Agored.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.estrogens catechol o sgistosomau a llyngyr yr iau a chanser sy'n gysylltiedig â helminth.blaen.poeth y tu mewn.5, 444 (2014).